幽门螺杆菌感染者胃内菌群特征分析

彭贤慧，周丽雅，何利华，宋志强，张建中

1.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病控制国家重点实验室，北京 102206； 2.浙江省杭州市感染性疾病诊治协同创新中心； 3.北京大学第三医院消化科



幽门螺杆菌感染者胃内菌群特征分析

彭贤慧1，2，周丽雅3，何利华1，2，宋志强3，张建中1，2

1.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病控制国家重点实验室，北京 102206； 2.浙江省杭州市感染性疾病诊治协同创新中心； 3.北京大学第三医院消化科

目的 通过比较幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染者和H.pylori阴性健康人群胃内菌群差异，探讨H.pylori对胃内菌群的影响。方法 30例H.pylori感染者和30名H.pylori阴性健康志愿者胃黏膜标本，经组织研磨匀浆后提取基因组，对16S rDNA基因V3-V4高变区进行扩增，构建小片段文库，基于Illumina HiSeq 2000测序平台，利用250 bp Paired-End的方法进行双末端测序。下机数据经过生物信息处理后，得到有效序列，以97%一致性将序列聚类成为OTUs，经聚类及物种注释后获得每个样本在各分类水平的分布情况。比较分析两组样品α多样性差异和β多样性差异。统计分析两组在各分类水平相对丰度变化情况。寻找因H.pylori感染引起相对丰度发生显著变化的物种。结果 与H.pylori阴性对照组相比，H.pylori阳性组α多样性显著降低。β多样性结果显示，组内的菌群结构相似度高，而组间的菌群相似度较低。H.pylori阴性对照组内优势菌属为Shewanella、Streptococcus、Escherichia、Pseudomonas、Prevotella、Neisseria、Oscillospira；而H.pylori阳性组内优势菌属为Helicobacter、Prevotella、Pseudomonas、Fusobacterium和Streptococcus。H.pylori阳性组内Streptococcus、Prevotella、Fusobacterium、Campylobacter、Porphyromonas、Rothia、Neisseria、Heamophilus[Prevotella]、Veillonella、Leptotrichia、Actinomyces、Bulleidia相对丰度显著升高；而阴性对照组Shewanella显著升高。结论H.pylori能够显著影响胃黏膜菌群结构，H.pylori可能与胃内菌群共同促进消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤的发生、发展。

幽门螺杆菌；胃黏膜菌群；高通量测序

长久以来，由于胃酸屏障，人们认为胃内是无菌的。然而1983年，Marshall和Warren共同发现了一种螺旋状的革兰氏阴性菌，即幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)，该菌的发现彻底改变这一观念。研究表明这一古老的病原体与人类共同进化的历史超过60 000多年。全球超过一半的人口感染H.pylori，多数为无症状感染，约10%的人发展为消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤等[1-3]。H.pylori感染机体后为何会产生不同症状，其致病机制仍不明确。越来越多证据表明，H.pylori菌株[2-4]、宿主[1-3]、环境[2]等多方面因素共同决定了疾病的发生、发展。胃内菌群作为胃内微生态环境的重要组成部分，通过多种调控途径维持胃内环境的平衡[5]。一旦菌群结构发生改变，这种平衡势必被打破，就会导致疾病的产生[6]。H.pylori作为胃内最重要的定植菌，是否影响胃内菌群结构及如何影响胃内菌群结构，解决这些问题有助于探究H.pylori的致病机理及为H.pylori相关疾病的治疗提供新思路。

本研究选择首次施行内镜检测并未接受任何药物治疗的消化不良患者为研究对象，根据H.pylori特异基因荧光定量PCR判定胃黏膜样本H.pylori感染状况，将样本分为H.pylori阳性组和H.pylori阴性对照组。通过基于Illumina Hiseq 2000测序平台，利用Pair-end双末端测序法，对细菌16S rDNA进行高通量测序分析，比较H.pylori阳性组和H.pylori阴性对照组菌群差异，探索因H.pylori感染引起的菌群结构和组成的变化。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年3月北京大学第三医院消化内科H.pylori阳性患者30例，H.pylori阴性健康志愿者30名。纳入标准：H.pylori阳性组(HP组)：13C呼气试验阳性、PCR阳性。H.pylori阴性对照组(HN组)：13C呼气试验阴性、PCR阴性。所有受试者1个月内未服用抗生素、微生态制剂、质子泵抑制剂、H2受体拮抗剂等影响胃内菌群的药物。HP组男18例，女12例，年龄(41.3±12.5)岁(24～68岁)；HN组男16名，女14名，年龄(38.9±12.1)岁(20～69岁)。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要试剂 QIAamp®DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)；Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs，USA)；Qiagen Gel Extraction Kit(QIAGEN，Germany)；TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit(Illumina，USA)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：受试者签署知情同意书后，胃镜下分别钳取受试者胃窦、胃体黏膜活检样本各1块，大小约1 mm×2 mm。取材后标本置于无菌冻存管中并加入500 μl生理盐水，立即于-80 ℃保存。

1.3.2 基因组DNA提取和16S rDNA扩增子测序：将胃黏膜组织连同生理盐水转移至组织研磨器进行组织匀浆，使用试剂盒QIAamp®DNA Mini Kit(QIAGEN，Germany)获取样本总DNA，具体操作步骤见说明书。提取的总DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和纯度。以此为模板，采用带Barcode的特异性引物对16S rDNA V3-V4区进行扩增，引物序列为：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)。扩增子经纯化、文库制备后进行定量，所有扩增子等量混合建库，本研究基于Illumina HiSeq测序平台，利用双末端测序(Paired-End)的方法， 对构建的小片段文库进行双末端测序。

1.3.3 测序数据处理：使用QIIME(Version 1.7.0)软件对低质量下机数据(Raw Data)进行预处理，经过拆分、截取、过滤、去除嵌合体后最终获得有效数据，然后利用Uparse软件对所有有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，选择出现频率最高的OTUs作为代表序列。利用RDP Classifier(Version 2.2)和Greengenes数据库对代表OTUs进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，分别在各分类水平(界、门、纲、目、科、属、种)统计各样本的群落组成。后续的α多样性分析和β多样性分析都是基于均一化处理后的数据。对各样品的数据进行均一化处理，以样品中数量最少的作为标准进行均一化处理，后续的α多样性分析和β多样性分析都是基于均一化处理后的数据。

1.4 统计学分析 单样品的多样性(α多样性)分析可以反映微生物群落的丰度和多样性，其中用于计算菌群多样性的指数有Shannon和Simpson，计算菌群丰度的指数有Chao1和ACE。统计各样本在各分类群的分布情况，并用柱状图进行可视化展示。用稀释曲线(Rarefaction curve)来反映测序数据的合理性和间接展示样品中物种丰富度。One-wayANOVA比较HP组和HN组α多样性指数的差异。基于系统发生关系的Weighted Unifrac距离可用于衡量群落之间的差异大小。基于Weighted Unifrac 距离的NMDS分析用于反映不同分组样本间的差异(β多样性)。为了研究样本间及组间样本的相似性，基于Weighted Unifrac距离对所有样品进行聚类分析，得到UPGMA聚类树。

2 结果

2.1 16S rRNA V3-V4区序列测序数据统计 本研究采用Illumina HiSeq 2000测序平台对60例胃黏膜标本微生物群落16S rRNA V3-V4区进行测序，测序得到的原始下机数据经过数据预处理及质控(拼接、过滤、去嵌合体)后，得到可用于后续分析的有效数据共计2 680 204条(44 670±13 021)，有效序列的平均读长为420 bp。以97%一致性将序列聚类成为OTUs，利用QIIME软件计算共得到43 642个OTUs(HP：13 448，HN：30 194)。

2.2 稀释曲线 随着测序深度的增加，所得注释细菌物种数量也不断增加，当随机抽取的测序序列条数为8 000时，各样本的稀释曲线到达平台期上升缓慢，说明目前的测序数据量能够覆盖绝大多数细菌物种，满足后续分析。此外,HN组物种丰度显著高于HP组(见图1)。

2.3 α多样性分析 经过均一化后，得到可用于进一步分析的序列数目为8 178条。对不同样品的97%一致性阈值水平下的α多样性分析指数进行统计，结果表明，HP组和HN组Shannon指数分别为2.16±1.31和5.10±1.17，Simpson指数分别为0.41±0.25和0.85±0.10，Chao1指数分别为394.48±125.46和1 060.97±409.77，ACE指数分别为419.53±126.32和1 125.69±421.30。One-wayANOVA统计分析表明HP组和HN组α多样性指数存在显著性差异(P<0.01)。说明HN组无论在物种丰度还是物种多样性上均显著高于HP组。进一步表明，H.pylori的感染会显著降低胃黏膜细菌群落的多样性(见图2)。

图1 HP组和HN组稀释性曲线Fig 1 Dilution curve of HP group and HN group

图2 HP组和HN组α多样性指数比较 A：Shannon 指数；B：Simpson 指数；C：Chao1 指数；D：ACE 指数

Fig 2 Comparison of α diversity indexes between HP group and HN group A: Shannon index; B: Simpson index; C: Chao1 index; D: ACE index

2.4 β多样性分析 非度量多维尺度分析(non-metric multi-dimensional scaling，NMDS)是一种将多维空间的研究对象简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的数据分析方法。基于Weighted Unifrac的NMDS分析可以揭示样品之间微生物群落的相似性。如果两样品间距离越近，则Weighted Unifrac距离矩阵值越小，说明两个群落构成越相似(同时考虑物种类别和物种相对丰度)。利用QIIME计算基于物种相对丰度的β多样性距离矩阵，并用R软件(Version 3.2.0)的Vegan包绘制NMDS展示图。如图3所示，除个别离散点外，HP组和HN组内样品明显聚集于两个不同区域，后续我们使用基于Weighted Unifrac的UPGMA法对所有样品的细菌群落构成的相似性进行聚类分析，结果如图4所示，除样本HN0416和HN0456外，所有样本按照HP组和HN组的分组明显划分为两大分类群，综上所述，HP组和HN组各样品细菌群落无论在物种类别还是相对丰度上均显著不同。

图3 基于Weighted Unifrac距离的NMDS分析Fig 3 NMDS analysis based on Weighted Unifrac distance

图4 基于Weighted Unifrac距离的UPGMA聚类树Fig 4 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

2.5 优势物种相对丰度展示 根据物种注释结果，分别选取每个样品在属水平和门水平上相对丰度排名前十的物种，生成物种相对丰度柱形累加图。在属水平，HP组内5个优势物种Helicobacter、Prevotella、Pseudomonas、Fusobacterium和Streptococcus(相对丰度>1%)相对丰度之和所占比例超过80%；而HN组Shewanella、Streptococcus、Escherichia、Pseudomonas、Prevotella、Neisseria、Oscillospira7个优势物种仅占细菌总量的21.5%。在门水平，HP组Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria4个优势物种占细菌总量的90%以上；而HN组Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria5个优势物种占细菌总量的80%以上(见图5)。

2.6 组间物种差异分析 为了寻找各分类水平下组间的差异物种，做组间的T检验(SPSS 16.0)，找出差异显著的物种。因两组内H.pylori相对丰度比例悬殊，为了避免这种干扰，需剔除H.pylori后进行后续统计分析。图6A为门水平组间差异物种的比较，两组间存在显著差异的菌门有5个，与HN组相比，HP组发生显著升高的菌门为Firmicutes、Bacteroidetes、Fusobacteria和Actinobacteria；发生显著降低的菌门为Proteobacteria。图6B为属水平组间差异物种比较的结果，相对丰度发生显著变化的共计14个菌属，其中13个菌属HP组显著高于HN组；仅Shewanella在HN组发生显著升高。这些相对丰度发生显著变化的菌属主要分布于Proteobacteria、Fusobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria5个菌门。

图5 物种相对丰度柱形图 A：门水平上；B：属水平上Fig 5 Relative abundance of species A: the phylum level; B: the genus level

注：左图为组间差异物种丰度展示，图中每个条形分别表示在分组间丰度差异显著的物种在每个组中的均值。右图为组间差异置信度展示，图中每个圈的最左端点表示均值差的95%CI下限，圆圈的最右端点表示均值差95%CI上限。圆圈的圆心代表的是均值的差。圆圈颜色所代表的组为均值高的组。展示结果的最右端是对应差异物种的组间显著性检验P值。

图6 组间物种差异分析 A：门水平上； B： 属水平上
Fig 6 Species difference analysis between two groups A: the phylum level; B: the genus level

2.7 组间群落标志物 LEfSe(LDA Effect Size)是一种用于发现高维生物标识的统计分析软件，能够在组与组之间寻找具有统计学差异的生物标识(Biomarker)，即组间差异显著的物种。当LDA设置为4.5时，Helicobacter、Epsilonproteobacteria、Campylobacterales、Helicobacteraceae、Proteobacteria在HP组升高；而HN组Gammaproteobacteria、Alteromonadales、Shewanella、Shewanellaceae、Firmicutes、Vibrionales、Enterobacteriaceae和Enterobacteriales等物种相对丰度显著升高(见图7)。

图7 基于LEfSe统计的HP组和HN组物种相对丰度比较Fig 7 Comparison of relative abundance of species in HP group and HN group based on LEfSe statistics

3 讨论

越来越多研究[7-9]表明，除H.pylori外，胃黏膜还存在大量微生物，这些微生物共同构成了具有自身特征的胃黏膜微生物群落。传统上，研究胃内微生物群落特征的方法主要依赖于黏膜组织或内容物的分离培养。然而受限于培养条件，80%的细菌是不可培养的[10]。因此，传统的分离培养方法很难全面地认识胃黏膜菌群分布特征。目前基于非培养的分子生物学方法主要包括变性凝胶电泳技术(DGGE)、末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)、基于16S rDNA的克隆文库法和基因芯片技术等[11]。Bik等[12]利用克隆文库的方法对分离自23例患者胃活检标本的1 833个单克隆进行测序，鉴定得到共128个菌种，这些菌主要分布于8个菌门，研究发现H.pylori的存在不会对这些菌门的丰度产生影响。Maldonado-Contreras等[9]利用PhyloChip芯片法对12例患者的胃黏膜标本进行检测，研究发现在所有标本中相对丰度最高的是变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)这4个门类，并认为H.pylori阳性标本与H.pylori阴性标本在这4个门类具有相似的构成，HN组具有较高丰度的放线菌门和厚壁菌门，而HP组却具有较高丰度的酸杆菌门和非螺杆菌变形菌门。然而无法避免的是这些方法同样存在问题：灵敏度较低、PCR的偏好性、克隆导致的取样不足、仅能针对已知菌检测等[13]。高通量测序技术的出现能在很大程度上克服以上缺陷，因其通量高、速度快、准确度高、可进行Pair-end双向测序等优势越来越广泛地应用于微生态的研究中，让我们对微生物群落的研究在认知深度和广度上有了大幅提高。

H.pylori作为胃内最重要的病原体，并非唯一的病原体。越来越多证据表明，胃内存在独特的微生物群落。维持胃内微生态环境平衡至关重要，一旦这种平衡打破，可能会导致慢性胃炎、消化性溃疡、胃腺癌和黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生、发展。为了探索H.pylori对胃黏膜菌群的影响，本研究基于Illumina高通量测序平台，采用Pair-end双末端测序的方法，对细菌的16S rDNA进行高通量测序分析，通过比较HP组和HN组的菌群差异，试图探索H.pylori感染所引起的菌群变化情况。

本研究结果表明，H.pylori感染机体后，胃内菌群的α多样性显著降低，这一变化既包括物种数量的显著下降也包括物种相对丰度的显著下降。β多样性分析的结果表明，两组内的菌群结构相似性均较高，而两组间的菌群结构差异显著，相似性低。近年来，Prevotella被证实与炎症反应密切相关，并随着Prevotella相对丰度升高，炎症反应程度会加剧[14]。同时，Fusobacterium被认为是一种致炎性微生物，它能够抑制T细胞应答、促进炎症因子的表达[15-16]。此外，亚硝基化合物(N-nitroso compounds)的合成能够增加胃癌的风险[17-18]，多种细菌可以通过自身的亚硝基酶将亚硝酸盐还原成这种化合物，这些细菌包括Clostridium、Veillonella、Haemophilus、Staphylococcus和Neisseria等[17-18]。在本研究中，我们发现，Prevotella、Fusobacterium、Nesseria、Veillonella的相对丰度在H.pylori阳性组显著升高。H.pylori可能与这些细菌相互作用，共同导致胃内一系列疾病的发生、发展。

综上所述，H.pylori的定植会显著改变胃黏膜的菌群结构，并且消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌、MALT淋巴瘤等疾病的发生、发展可能是H.pylori和周围菌群共同作用的结果。因此，了解H.pylori感染对胃内菌群结构的影响，可能为基于微生态治疗胃内疾病提供新思路。

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(责任编辑：李 健)

Characterization of Helicobacter pylori-infected gastric microbiota

PENG Xianhui1,2, ZHOU Liya3, HE Lihua1,2, SONG Zhiqiang3, ZHANG Jianzhong1,2

1.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206; 2.Collaborative Innovation Center Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases in Hangzhou; 3.Department of Gastroenterology, Peking University Third Hospital, China

Objective To investigate the effects ofH.pylorion gastric microbiota by comparing the difference of gastric microbiota betweenH.pylori-positive and -negative individuals.Methods Genome was extracted after homogenate from gastric biopsies of 30H.pylori-positive cases and 30H.pylori-negative cases. The hypervariable region of 16S rDNA gene were amplified and a small fragment library was constructed cases. 250 bp Paired-End sequencing were conducted based on Illumina HiSeq 2000 sequencing platform. Raw data were processed by bioinformatics method and then the effective sequence was obtained, the sequence was clustered into the OTUs with 97% consistency. After the clustering and species annotation, the distribution of each sample was obtained in each class. The distribution of each sample in the categories level was obtained. The statistical difference of α diversity, β diversity between two groups were analyzed. Significant species in relative abundance were analyzed in two groups.Results Compared withH.pylori-negative control group, α diversity ofH.pylori-positive group was significantly decreased. The results showed that the similarity of the within-group on gastric microbiota was high, and the similarity between two groups was low. The predominant strains ofH.pylori-negative control group wereShewanella,Streptococcus,Escherichia,Pseudomonas,Prevotella,Neisseria,Oscillospira. WhileHelicobacter,Prevotella,Pseudomonas,FusobacteriumandStreptococcuswere the dominant strains inH.pylori-positive group. The relative abundance ofStreptococcus,Prevotella,Fusobacterium,Campylobacter,Porphyromonas,Rothia,Neisseria,Heamophilus[Prevotella],Veillonella,Leptotrichia,Actinomyces,BulleidiainH.pylori-positive group were significantly higher than those inH.pylori-negative control group.ConclusionH.pylorican significantly affect the structure and composition of gastric microbiota.H.pyloriand surrounding gastric microbiota may jointly promote the development of peptic ulcer, atrophic gastritis, gastric cancer and MALT lymphoma.

Helicobacter pylori; Gastric microbiota; High throughput sequencing

“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAI06B02)

彭贤慧，博士研究生，研究方向：胃内微生态。E-mail：pxhhappy@126.com

张建中，研究员，博士生导师，研究方向：幽门螺杆菌致病机制。E-mail：zhangjianzhong@icdc.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.06.010

R378

A

1006-5709(2017)06-0658-06

2017-04-12