晚期消化道肿瘤患者CD8 + T 细胞表面程序性凋亡受体表达特点及临床意义

张 誉，胡 欣

中国人民解放军第一〇五医院干部病房，安徽 合肥230031

程序性凋亡受体1 (programmed death-1，PD-1)是具有单一胞外免疫球蛋白V 样功能区的I 型穿膜蛋白，属免疫球蛋白超家族成员。PD-1 是程序性凋亡受体家族中的代表，也是B7/CD28 超家族中第2 个抑制性受体功能的受体，第1 个发现的抑制性功能细胞是毒性T 淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen4，CTLA-4)。PD-1 和CTLA-4 都能有效抑制T 细胞免疫的初期活化，其中PD-1 能抑制T 细胞抗原受体(TCR)的信号传导，与肿瘤发生及多种自身免疫性疾病密切相关，最初是在凋亡的T 细胞杂交瘤中利用消减杂交的方法得到的，又称CD279，是近年来发现的负性共刺激信号之一，其高度表达与T 细胞免疫缺陷密切相关。T 细胞表面PD-1 及其配体(PD-1)结合的相互作用，抑制肿瘤抗原特异性T 细胞的活化，导致肿瘤免疫逃逸［1-3］。消化道肿瘤在全世界很多国家发病率都很高，中国是发病率较高的国家。消化道肿瘤早期症状隐匿，经常到晚期才得到诊断。本研究目的在于通过检测消化道肿瘤患者外周血T 细胞PD 的表达水平及病变程度，外周血T 细胞PD-1 的表达的水平与正常人的差异，探讨PD-1 的表达与消化道肿瘤的发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011 年1 月-2013 年12 月解放军105 医院消化道肿瘤患者58 例，男42 例，女16例;年龄45 ～75 岁，平均年龄(65 ±7.3)岁，诊断标准符合2010 中国版《消化道肿瘤临床实践指南》的诊断标准［4-5］，且均排除转移性消化道肿瘤，术前均未行免疫干预治疗，术后经病理证实(见图1)。其中胃癌27例，食管癌18 例，结肠癌13 例。对所有入组患者进行TNM 分期，其中I 期7 例，Ⅱ期13 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期10 例。健康对照组是体检中心随机选取的健康体检者34 名，男25 例，女9 例;年龄45 ～75 岁，平均年龄(61.6 ±8.79)岁。所有入组患者及健康体检者均签署知情同意书，并且通过解放军第105 医院伦理委员会认可。

图1 消化道肿瘤病理图 A:胃癌;B ～C:结肠癌;D:食管癌Fig 1 The pathological picture of degestive tumor A:gastric cancer;B ～C:colon cance;D:esophageal cance

1.2 主要试剂和仪器 人免疫学实验所用PD-1 抗体购自美国BD 公司，来自小鼠及小鼠抗人PD-1，PE(藻红蛋白)通道，同型对照为无荧光染色的鼠抗人IgG1。T 细胞分群主要是PerCP(多甲藻叶绿素蛋白)标记的CD8，APC(别藻青蛋白)标记的CD4 及其相应的鼠抗人同型抗体购自eBioscience 公司，莱兹公司提供分装。流式细胞仪购自美国BD 公司，实验用PBS 由本实验室配制，微量移液器购自康宁公司。

1.3 主要检测方法

1.3.1 免疫组化:常规固定包埋切片等过程省略，HE 染色过程:(1)将已入蒸馏水的切片放入苏木精水溶液中染色10 min;(2)酸水及氨水中分色，各数秒钟;(3)流水冲洗1 h 后入蒸馏水片刻;(4)入70%和90%酒精中脱水各10 min;(5)入酒精伊红染色液染色2 ～3 min。

1.3.2 流式细胞仪分析T 细胞PD-1 的表达:批量标本统一按以下程序检测，先将新鲜血液分离PBMC，平均分入两个流式检测管中，各加入105左右个细胞，一支检测管加入PerCp-CD8，20 μl，APC-CD4，PD-1-PE 20 μl;另一支试管加入同型对照抗体矫正荧光通道，20 ℃避光储存30 min。加入1ml PBS 洗涤液除去未结合抗体，振荡后离心1 500 r/min，弃上清，加入1%多聚甲醛固定，上机检测，用Fac-FlowJo 软件分析数据得出结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行统计分析，定量数据用x-±s 表示，两独立样本非参数检验比较两组计量资料，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血CD8+T 细胞表面PD-1 的阳性表达情况

消化道肿瘤患者PD-1 在外周血CD8+T 细胞表面的阳性表达比例明显高于健康对照者，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图2)。

2.2 外周血CD8+T 细胞表面PD-1 的表达水平 外周血进行流式细胞仪分析结果:肿瘤组患者外周血CD8+T 细胞表面PD-1 阳性表达水平明显高于健康对照组(7.22 ±4.27，P =0.0021 vs 16.72 ±4.21，P =0.0037)，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图3A)。

2.3 PD-1 在肿瘤不同分期的表达 在4 种不同分期的消化道肿瘤患者外周血CD8+T 细胞表面PD-1 表达的频率不同，且与消化道肿瘤的恶性度呈正相关，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图3B)。

图2 CD8 +T 细胞表达PD-1 的典型图Fig 2 The typical illustration of PD-1 in CD8 +T cell

图3 外周血CD8 +T 细胞表面PD-1 的表达Fig 3 Expression of PD-1 in CD8 +T cells surface in peripheral blood

3 讨论

随着对肿瘤的生物学行为研究的不断深入，肿瘤的免疫治疗逐渐成为研究者关注的焦点，肿瘤的免疫疗法是以激发和增强机体的免疫功能达到控制和杀灭肿瘤细胞为目的。免疫疗法除能清除少量的、播散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。肿瘤免疫治疗可弥补传统手术及放化疗的不足，成为一种有效的疗法而广泛应用于临床。免疫治疗与传统疗法的区别是针对靶点，有的放矢，减少对正常细胞的杀伤，高效、特异性的清除异性细胞。但是，肿瘤细胞是通过多种途径逃避机体的免疫监控和杀伤。因此，寻找特异性高、作用范围广的靶点成为关键。T 细胞对特异性抗原的应答和耐受在维持机体免疫平衡的过程中发挥着关键作用。PD-1 的高度表达与T 细胞免疫缺陷密切相关。在肿瘤免疫应答过程中，肿瘤抗原特异性T细胞的诱导凋亡以及免疫反应降低是肿瘤细胞免疫逃逸中的主要机制。研究发现PD-1 所在的信号通路正是许多癌细胞实现免疫逃逸的重要途径［6-7］。T 细胞表面的PD-1 与其配体(PD-L1)结合后，可抑制肿瘤抗原特异性T 细胞的活化，诱导并维持T 细胞对肿瘤细胞免疫耐受，导致肿瘤避免免疫杀伤［8］。研究表明，PD-1/PD-L1 信号通路抑制肿瘤抗原特异性T 细胞的活化，而阻断PD-1/PD-L1 信号途径后，肿瘤生长变得非常缓慢，因此，PD-1 通路是探讨肿瘤免疫治疗的一个新途径［9］。同理，在人类癌组织中均可检测到PD-1，即PD-L1 蛋白的表达［10］。有学者应用流式细胞分析泌尿系统癌细胞中PD-1 分子的表达，结果显示CD4+/CD8+T 细胞上均高表达PD-1 分子，而且PD-1的表达强度与CD4+/CD8+之比呈负相关［11］。PD-1在乳腺癌细胞中的表达强度与癌组织的大小、病理分型及淋巴组织浸润显著呈正相关［15］。卵巢癌中发现肿瘤细胞PD-1 的表达水平与CD8+T 的浸润程度及患者预后呈负相关［15］。Konishi 等［14］在检测到PD-1 在非小细胞肺癌中高表达。Shi 等［15］则在肝细胞癌中发现PD-1 高表达。本研究结果显示消化道肿瘤外周血CD8+T 细胞表面PD-1 的表达率较正常人明显上调，且与消化道肿瘤的不同分型呈正相关;关于PD-1/PDL1 信号通路和消化道肿瘤的磁系的研究正处于探索阶段，仍需要进一步研究。

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