胆汁内外引流术对梗阻性黄疸大鼠肝脏Kupffer 细胞CD14 表达的影响

黄学飞，李 闻

1.海军总医院干部病房消化内科，北京100048;2.中国人民解放军总医院消化内科

梗阻性黄疸(obstructive jaundice，OJ)是临床常见病，患者常并发感染死于败血症，提示OJ 患者免疫功能减退。内毒素血症是造成OJ 患者免疫功能损伤的主要因素，此时肝脏Kupffer 细胞的免疫功能受到抑制，清除内毒素的能力下降，从而导致内毒素血症的形成。近年来随着内镜和超声微创治疗技术的发展，经内镜胆汁内引流术和经皮经肝胆汁外引流术成为减黄治疗的主要手段。有研究显示［1］，胆汁内引流能明显改善OJ 患者的内毒素血症，并恢复患者的肝功能和Kupffer 细胞免疫功能，而外引流术对改善内毒素血症的作用尚有争论。CD14 作为表达于Kupffer 细胞表面的内毒素的受体，可能参与了OJ 的免疫抑制过程，并与胆汁内外引流术的不同结果相关。本研究通过观察胆道梗阻及内、外引流术解除梗阻对肝脏Kupffer 细胞CD14 表达的影响，进一步探讨内、外引流术在恢复梗阻性黄疸Kupffer 细胞免疫功能方面的机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，体质量270 ～300 g，购自军事医学科学院实验动物中心。在解放军总医院Ⅱ级动物实验室分笼单独饲养，常规饲料喂养，自由进食与饮水，维持环境温度15 ～20 ℃。

1.2 主要试剂 兔抗大鼠CD14 多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，PV-6001 二步法免疫组化检测试剂盒及浓缩型DAB 试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的建立及分组:将60 只大鼠随机分为4 组:假手术组(SH，n=15)、梗阻性黄疸组(OJ，n=15)、胆汁内引流组(ID，n =15)、胆汁外引流组(ED，n=15)。采用改良的手术方法制备动物模型。OJ 组:大鼠开腹分离胆总管并结扎、切断，建立OJ 模型;7 d后行第2 次手术，分离胆总管但不引流。ID 组:OJ 模型建成7 d 后二次手术，于扩张的胆总管和十二指肠之间植入内引流管。ED 组:OJ 模型建成7 d 后二次手术，从扩张的胆总管末端插入外引流管，经皮下引至颈背部体外并固定。SH 组:大鼠开腹分离胆总管但不结扎，7 d 后二次手术分离胆管但不引流。观察并记录大鼠的一般情况及体质量变化。各组大鼠均于二次手术后第7 天腹腔注射3%戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉，开腹留取肝脏组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋并切片备用。

1.3.2 肝脏Kupffer 细胞CD14 表达的测定:采用免疫组化方法，石蜡切片常规二甲苯脱蜡，高压锅抗原修复30 s，3% H2O2室温孵育8 min，滴加1∶200 的兔抗大鼠CD14 抗体，4 ℃冰箱过夜;滴加二抗(山羊抗兔IgG 抗体-HRP 多聚体，PV-6001)，37 ℃，30 min 后，DAB 显色。

1.3.3 图像分析技术:通过显微图像分析技术，测定CD14 阳性反应物的平均积分光密度值(IOD/area)，其中IOD 为待测定区域阳性染色的积分光密度，area为待测定区域的面积。将切片置于与图象分析系统相连的显微镜下(400 ×)，选定待测区，采集数据。每张切片随机选取5 个视野，取其平均值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5 统计学软件进行数据分析，所测数据均用x ±s 描述，多组间比较采用方差分析，P ＜0.01 为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量变化 SH 组大鼠体质量增加明显，而胆管结扎后，OJ 组大鼠体质量增加比较缓慢。第7天和第14 天，假手术组与OJ 组大鼠体质量比较，差异均具有显著统计学意义(P ＜0.01)。解除梗阻后，ID组大鼠体质量增加明显，而ED 组大鼠体质量反而下降。第7 天ID 组和ED 组大鼠体质量比较，差异无统计学意义(P=0.678);而第14 天两组大鼠体质量比较，差异具有显著统计学意义(P ＜0.01，见图1)。

2.2 大鼠肝脏Kupffer 细胞CD14 的表达 CD14 阳性细胞呈棕黄色，甚至棕褐色，主要表达于Kupffer 细胞，表现为肝窦边缘及汇管区的星形细胞阳性表达。部分肝细胞及汇管区浸润的白细胞也可见黄染(见图2)。图像分析结果:SH 组、OJ 组、ID 组和ED 组肝脏CD14 染色的平均积分光密度值(IOD/area)分别为:0.001355 ±0.000822、0.015557±0.002135、0.001548±0. 001024、0. 008570 ± 0. 001893。OJ 组 大 鼠 肝 脏CD14 表达IOD/area 明显增强，与SH 组IOD/area 比较，差异具有统计学意义(P ＜0.01);ID 组IOD/area与OJ 组比较明显降低(P ＜0.01);而ED 组与OJ 组比较，差异无统计学意义(P=0.5907，见图3)。

图1 4 组大鼠模型体质量变化趋势Fig 1 Changes of rats body weight among the four groups

3 讨论

内毒素受体CD14 是机体免疫反应过程中的关键因素之一。体内CD14 存在两种形式，表达于细胞表面的mCD14(membrane CD14)和血清中可溶性的sCD14(soluble CD14)。mCD14 表达于成熟的髓系细胞(单核细胞、巨噬细胞、多形核细胞)、B 细胞表面。在肝脏CD14 主要表达于Kupffer 细胞。CD14 识别血中的内毒素(LPS)并与其结合引发免疫细胞的一系列信号转导过程，激活NF-κB 等转录因子。CD14 在LPS 介导炎症反应过程中处于核心地位因Kupffer 细胞是肝脏表达CD14 的主要细胞，因而实验大鼠肝脏组织CD14 的表达变化反应了Kupffer 细胞CD14 表达情况。在本研究中，OJ 组大鼠肝脏CD14 表达与SH 组比较明显升高。CD14 表达的异常升高提示OJ 大鼠Kupffer 细胞被激活，并介导对内毒素的免疫及炎症反应。Miyaso 等［2］报道OJ 时Kupffer 细胞CD14 的表达明显增强。LPS 即是CD14 的配体又是CD14 表达的激活因素，体内实验及体外研究均表明LPS 可以上调Kupffer 细胞CD14 的表达［3-4］。临床研究发现，OJ 患者有明显的内毒素血症［5］。因此我们考虑OJ 大鼠Kupffer 细胞CD14 表达增高是内毒素持续刺激的结果。

本研究发现胆汁内引流术解除胆道梗阻后，大鼠肝脏CD14 的表达明显下降;而外引流术后，大鼠肝脏CD14 的表达下降不明显。表明胆汁内引流术在恢复Kupffer 细胞CD14 表达方面优于胆汁外引流术。这可能与引流方法致胆汁的得失有关。胆汁内引流恢复了正常的胆汁排泄途径，胆汁流入肠道，有利于抑制肠内细菌的繁殖;另外排入肠道的胆汁可以协助食物的消化、促进营养物质的吸收，恢复了肠肝循环，增强了机体免疫力［6］。尽管在我们前期的研究中发现胆汁外引流组大鼠血清内毒素水平也可降低［7］，但胆汁外引流不能建立胆盐正常的肠肝循环，胆汁中的大量胆盐及sIgA 等通过外引流丢失，失去了对机体的保护作用，容易诱发内毒素及细菌入血。外引流大鼠体内可能存在低水平的内毒素持续刺激，从而激活Kupffer 细胞CD14 的表达，以清除持续进入门脉的内毒素和细菌。在我们的实验中也观察到内引流解除胆道梗阻以后，大鼠体质量明显增加，而外引流大鼠的体质量反而下降，提示外引流大鼠由于胆汁丢失营养状况变差。推测本实验中两种引流方法所致大鼠肝脏Kupffer 细胞CD14 表达的差异可能与胆盐、肠屏障、肠肝循环、和营养状态等因素有关。

图2 4 组大鼠肝脏CD14 免疫组化染色结果(400 ×) A:SH 组，CD14 阳性染色主要位于肝窦边缘及汇管区的Kupffer 细胞胞膜，SH 组大鼠肝脏Kupffer 细胞CD14 染色较弱;B:OJ 组，CD14 染色明显增强;C:ID 组，CD14 阳性染色较OJ 组明显降低;D:ED 组，CD14 阳性染色仍较明显Fig 2 Representative immunohistochemical staining of CD14 in rats liver tissues among four groups (400 ×) A:In SH group，the positive staining of CD14 was detected mainly in the membrane of Kupffer cell on the edge of liver sinusoid and portal areas. There was slight expression of CD14 in SH group;B:In OJ group，the expression of CD14 was stronger as compared to SH group;C:In ID group，the expression of CD14 was markedly suppressed;D:In ED group，the expression of CD14 was still at a high level

图3 4 组大鼠肝脏Kupffer 细胞CD14 表达情况比较Fig 3 Comparison of the expression of CD14 in rat liver Kupffer cells among four groups

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