TUDCA缓解小鼠肠炎对内质网应激与双氧化酶2表达的研究

梁 君， 高 强， 崔梅花， 郁卫东， 侯晓琳， 杨 成， 李 想

1.北京大学航天临床医学院 航天中心医院消化科，北京100049； 2.河南科技大学第一附属医院消化科； 3.北京大学人民医院临床分子生物学研究所； 4.北京大学人民医院动物实验室

论著·肠相关疾病

TUDCA缓解小鼠肠炎对内质网应激与双氧化酶2表达的研究

梁 君1， 高 强2， 崔梅花1， 郁卫东3， 侯晓琳1， 杨 成1， 李 想4

1.北京大学航天临床医学院 航天中心医院消化科，北京100049； 2.河南科技大学第一附属医院消化科； 3.北京大学人民医院临床分子生物学研究所； 4.北京大学人民医院动物实验室

目的 探讨特异性内质网应激抑制剂牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholate, TUDCA)缓解DSS诱导的小鼠肠炎对内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)蛋白与肠黏膜过氧化氢产生酶双氧化酶2(dual oxidase2， Duox2)表达的研究。方法 7周C57BL/6J雄性小鼠适应喂养1周后随机分为对照组、炎症组、干预组。炎症组和干预组饮用2.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium, DSS)溶液诱导小鼠肠炎，干预组再以500 mg/kg的TUDCA灌胃。8 d后处死小鼠，收集结肠作HE和免疫组化染色，Western blotting检测Duox2及ERS相关蛋白Grp78、Atf6、P-Ire1α/Ire1α、Ire1β、P-Perk/Perk的表达。结果 TUDCA明显减轻DSS诱导的小鼠肠炎。Western blotting结果显示炎症组Grp78、P-Perk/Perk蛋白及Duox2表达均升高，干预组这三种蛋白表达恢复到对照组水平，其余ERS相关蛋白表达无变化。免疫组化结果显示Grp78和Duox2三组表达水平与Western blotting结果相一致。结论 TUDCA缓解小鼠肠炎可能与抑制内质网Grp78-Perk通路有关，该通路与Duox2表达相互影响。

溃疡性结肠炎；内质网应激；牛磺熊去氧胆酸；双氧化酶2

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是西方常见病，近年来在我国的发病率呈明显上升趋势[1]。临床上UC主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便；肠外症状如体质量减轻、贫血、关节疼痛；并发症有中毒性巨结肠和结肠癌等。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)是指细胞处于缺氧、氧化应激、毒素等环境时，未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔中聚集，Ca离子储存释放平衡失调，脂质代谢合成紊乱的状态。ERS有三条信号通路，起始蛋白分别为肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme-1, Ire1)、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase, Perk)、活化转录因子6(activating transcription factor 6，Atf6)，其中Ire1在体内有两种形式，Ire1α广泛表达，Ire1β表达于呼吸道和胃肠道表面。当细胞处于稳态时，这3种应激感受蛋白都与葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatory protein 78, Grp78)结合[2]。内质网应激出现时，Grp78从这3种感受器上解离而去结合错误折叠的蛋白，Grp78表达升高。使得Ire1、Perk和Atf6通路激活而表达有所变化。对于Perk和Ire1α通路蛋白，激活后转变为磷酸化形式即P-Perk和P-Ire1α。已有大量研究[3-4]表明ERS在UC发生、发展过程中起重要作用。而肠上皮细胞表达的双氧化酶2(Duox2)主要功能是产生过氧化氢(H2O2)，是肠道黏膜H2O2的重要来源[5]。H2O2作为活性氧(reactive oxygen species, ROS)的一种，可以诱导ERS发生。研究[6]证实ROS在结肠炎模型和患者黏膜中产生增加，且ROS在疾病早期阶段被观察到，并与疾病严重程度及进展相关[6]。本研究采用ERS特异性抑制剂牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)[7]干预肠炎小鼠后，观察研究ERS各指标的变化及肠上皮Duox2的变化，探讨ERS与Duox2可能的相互影响。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立健康雄性7周C57BL/6J小鼠，体质量20～23 g，购自北京华阜康公司，饲养于北京大学人民医院SPF级动物实验室。适应性喂养1周后，随机分为对照组、炎症组、干预组，每组14只。对照组自由饮水，炎症组和干预组饮用2.5%葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium, DSS)(美国MP biomedicals公司，分子量36 000～50 000 Da)，共8 d。干预组自饮用DSS第1天起，用500 mg/kg TUDCA(购自美国EMD chemicals公司)每天灌胃，TUDCA溶于无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)；对照组和炎症组用等量无菌PBS灌胃。8 d后颈椎脱臼法处死小鼠，测量结肠长度，自远端向近端取0.5 cm结肠置于4%多聚甲醛作HE染色和免疫组化染色，其余部分立即置于液氮中再转入-80 ℃冰箱保存用作蛋白免疫印迹(Western blotting)。

1.2 结肠炎症及TUDCA干预效果评价小鼠的观察内容包括疾病活动指数(disease activity index, DAI)[8]、组织学损伤评分(histological index, HI)[9]和体质量变化。隐血状况用联苯胺法试剂盒(南京建成公司)检测。

1.3 Western blotting检测相关蛋白表达Western blotting检测方法为：液氮研磨组织，常规裂解后进行总蛋白提取及变性，每孔上样50 μg。Western blotting数据分析为：目的蛋白灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差，所得结果为某样品目的蛋白相对含量。而以磷酸化形式激活的蛋白与其总蛋白之比(如P-Perk/Perk、P-Ire1α/Ire1α)为此蛋白的相对含量。

1.4 免疫组化染色常规组织切片脱蜡后进行，一抗与Western blotting所用来源为同一抗体。阴性对照玻片只滴加PBS。评分标准[10]：每张切片随机选择10个视野，每个视野观察100个细胞。染色强度：细胞质无染色0分，淡黄色1分，棕色2分，棕褐色3分；染色范围：<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分；两项标准乘积为每张切片的评分结果。

2 结果

2.1 小鼠结肠炎症情况对照组小鼠正常活动，毛发光泽，体质量上升。炎症组于第4天出现活动减少，稀便，肉眼血便，毛色无光泽，第5天始平均体质量明显下降。干预组于第5天平均体质量开始明显下降，出现隐血便，但始终未出现稀便，且活动正常，毛色光泽。第5～8天炎症组平均体质量下降幅度大于干预组(见图1)。对照组结肠黏膜完整、腺体排列整齐、结构正常。炎症组结肠黏膜炎症严重，炎症细胞浸润，黏膜不完整，腺体正常结构消失，排列紊乱。干预组可见炎症明显减轻，虽有腺体部分消失，但上皮完整，炎症细胞浸润不明显(见图2)。炎症组小鼠结肠长度明显缩短，TUDCA治疗后结肠长度有所恢复(见表1)。

2.2 Western blotting结果DSS诱导的肠炎小鼠结肠组织Duox2、Grp78、P-Perk/Perk蛋白表达量高，经TUDCA干预后表达明显下降，对照组表达量低(P<0.05)。而P-Ire1α/Ire1α、Atf6、Ire1β蛋白均在三组间表达差异无统计学意义(P>0.05，见图3)。

图1 三组小鼠体质量-时间变化比较

Fig 1 Comparison of the body weight-time of mice among three groups

注：与对照组比较，aP<0.05；与干预组比较，bP<0.05。

图2 8 d时三组小鼠结肠HE染色(400×)

注：与对照组比较，aP<0.05；与干预组比较，bP<0.05。

2.3 免疫组化染色结果Grp78和Duox2蛋白进行免疫组化染色，炎症组表达较对照组明显升高，经TUDCA干预后Grp78和Duox2蛋白的表达下降(见表2)。Grp78蛋白对照组表达于结肠上皮细胞质，炎症组Grp78在炎症区域明显染色，干预组染色强度和范围明显低于炎症组。Duox2蛋白在对照组主要表达于肠上皮刷状缘和细胞质，在炎症组的炎症区域内大范围染色，在干预组表达比炎症组明显降低，于结肠上皮刷状缘及部分炎性细胞的胞质染色(见图4)。

注：与对照组比较，aP<0.05；与干预组比较，bP<0.05。

图4 8 d时三组结肠免疫组化染色(400×) A：Grp78蛋白；B：Duox2蛋白

3 讨论

在UC发生、发展过程中，氧化应激被认为是导致肠道损伤的关键因素[11]。氧化应激是ROS和活性氮类(reactive nitrogen species, RNS)物质产生过多，超出机体氧化物的清除能力，导致细胞组织损伤的病理、生理过程。Duox2属于NADPH氧化酶家族[12]，Duox2是内质网定居蛋白，它的转录后储存修饰与内质网功能密切相关。它可以直接释放H2O2，是肠道黏膜H2O2的重要来源。H2O2是ROS的重要成员，临床研究[13]表明UC患者肠道黏膜Duox2蛋白表达上调且ERS在UC发病中起重要作用。而ROS是造成ERS发生的重要诱因，可以导致ERS信号通路激活[14]。

本研究采用DSS诱导小鼠UC模型，以ERS特异性抑制剂TUDCA干预后，通过DAI评分、HE染色镜下观察结肠黏膜病理改变，均表明TUDCA在小鼠结肠炎模型中，ERS干预有减轻炎症的效果[7]。TUDCA为ERS特异性抑制剂，临床主要以TUDCA治疗原发性胆汁性肝硬化或胆囊胆固醇结石等[15]。本实验采用Cao等[7]的方法，结果为Western blotting炎症组的结肠Duox2和Grp78、P-Perk/Perk表达量明显升高，而干预后Duox2、Grp78、P-Perk/Perk表达恢复到对照组水平，而ERS另两条通路蛋白Atf6、P-Ire1α/Ire1α、Ire1β三组表达量并无变化，原因可能是小鼠结肠炎急性期时，Grp78-Perk通路激活，而Atf6、Ire1α和Ire1β通路并未激活，或炎症组小鼠暂时的结肠上皮损伤导致了Atf6、Ire1α和Ire1β蛋白表达被抑制到了正常水平，这可能由于DSS处理后触发了细胞的保护反应[16]。本研究Western blotting结果显示同一组内，Perk和Duox2变化趋势一致，可能是由于肠道炎症发生时，Duox2表达增加，产生了过量的H2O2[17]，参与并促进了ERS的发生，使Grp78-Perk通路激活。反之，内质网通路激活后，影响Duox2的表达，促进了氧化应激的发展[18]。而免疫组化染色与Western blotting结果一致。显示Duox2、Grp78蛋白在对照组表达低，在炎症组炎症区域内染色强度和范围都明显增加，可能是参与炎症的其他细胞的上述蛋白表达量增加所致。干预组Duox2和Grp78表达显著低于炎症组。

非成熟形式的Duox2表达于内质网，而经加工成熟后的Duox2被运送到细胞膜表面[19],故免疫组化定位可见Duox2表达于胞浆和肠上皮细胞刷状缘。Duox2及其成熟因子Duox2能直接产生H2O2[18]。这对于杀菌和正常肠道防御是必要的，过多的H2O2产生则会对机体造成氧化应激损伤。有研究[20]发现，DSS处理小鼠后能直接诱导Duox2表达升高，表明Duox2可能在组织产生实质病理损伤前驱动炎症反应的发生。而破坏细胞内氧化还原平衡状态，会使细胞对于ERS的有害作用更敏感，且抑制ROS的产生，可以减轻ERS后造成的细胞凋亡。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related-factor2，Nrf2)是细胞应对氧化应激状态的主要调节因子[21]。Nrf2还是Perk的下游底物[22]。当Perk通路激活时，可使其特定位点磷酸化，导致Nrf2在细胞核中的累积，增加Nrf2靶基因的转录。而Perk-Nrf2的适度激活，可以促进氧化还原平衡及ERS后的细胞存活[23]。Perk-eIF2α-Atf4-Chop作为ERS发生的重要信号通路，Perk和其下游eIF2α蛋白重要的特性就是对氧化还原平衡状态的调节和使细胞适应因胞内ROS形成造成的氧化应激状态。这些特性主要由增加的Atf4合成和转录活性介导，导致抗氧化物基因的表达[24]。

本实验结果表明，TUDCA作为ERS特异性抑制剂，其减轻小鼠肠炎效果明显。TUDCA缓解肠炎后ERS通路之一Grp78/Perk表达降低说明TUDCA的治疗效果与抑制Grp78/Perk通路有关，且Duox2表达与Grp78/Perk一致，说明Perk信号通路可能对Duox2的表达有影响，具体作用机制还需进一步探索证明。TUDCA对小鼠肠炎的干预效果及对Duox2和Grp78-Perk通路表达的影响为今后临床UC的发病机制和治疗的研究提供新思路。

[1]Ouyang Q, Xue LY. Inflammatory bowel disease in the 21(st) century in China: turning challenges into opportunities [J]. J Dig Dis, 2012, 13(4): 195-199.

[2]Bogaert S, De Vos M, Olievier K, et al. Involvement of endoplasmic reticulum stress in inflammatory bowel disease: a different implication for colonic and ileal disease [J]. PLoS One, 2011, 6(10): e25589.

[3]Negroni A, Prete E, Vitali R, et al. Endoplasmic reticulum stress and unfolded protein response are involved in paediatric inflammatory bowel disease [J]. Dig Liver Dis, 2014, 46(9): 788-794.

[4]Kaser A, Adolph TE, Blumberg RS. The unfolded protein response and gastrointestinal disease [J]. Semin Immunopathol, 2013, 35(3): 307-319.

[5]Ameziane-El-Hassani R, Morand S, Boucher JL, et al. Dual oxidase-2 has an intrinsic Ca2+-dependent H2O2-generating activity [J]. J Biol Chem, 2005, 280(34): 30046-30054.

[6]Zhu H, Li YR. Oxidative stress and redox signaling mechanisms of inflammatory bowel disease: updated experimental and clinical evidence [J]. Exp Biol Med (Maywood), 2012, 237(5): 474-480.

[7]Cao SS, Zimmermann EM, Chuang BM, et al. The unfolded protein response and chemical chaperones reduce protein misfolding and colitis in mice [J]. Gastroenterology, 2013, 144(5): 989-1000， e6.

[8]Hamamoto N, Maemura K, Hirata I, et al. Inhibition of dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis in mice by intracolonically administered antibodies against adhesion molecules (endothelial leucocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1) or intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)) [J]. Clin Exp Immunol, 1999, 117(3): 462-468.

[9]Dieleman LA, Palmen MJ, Akol H, et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines [J]. Clin Exp Immunol, 1998, 114(3): 385-391.

[10]Krajewska M, Krajewski S, Epstein JI, et al. Immunohistochemical analysis of bcl-2, bax, bcl-x, and mcl-1 expression in prostate cancers [J]. Am J Pathol, 1996, 148(5): 1567-1576.

[11]Biasi F, Leonarduzzi G, Oteiza PI, et al. Inflammatory bowel disease: mechanisms, redox considerations, and therapeutic targets [J]. Antioxid Redox Signal, 2013, 19(14): 1711-1747.

[12]MacFie TS, Poulsom R, Parker A, et al. DUOX2 and DUOXA2 form the predominant enzyme system capable of producing the reactive oxygen species H2O2in active ulcerative colitis and are modulated by 5-aminosalicylic acid [J]. Inflamm Bowel Dis, 2014, 20(3): 514-524.

[13]Lipinski S, Till A, Sina C, et al. DUOX2-derived reactive oxygen species are effectors of NOD2-mediated antibacterial responses [J]. J Cell Sci, 2009, 122(Pt 19): 3522-3530.

[14]Chaudhari N, Talwar P, Parimisetty A, et al. A molecular web: endoplasmic reticulum stress, inflammation, and oxidative stress [J]. Front Cell Neurosci, 2014, 8: 213.

[15]Invernizzi P, Setchell KD, Crosignani A, et al. Differences in the metabolism and disposition of ursodeoxycholic acid and of its taurine-conjugated species in patients with primary biliary cirrhosis [J]. Hepatology, 1999, 29(2): 320-327.

[16]Okazaki T, Nishio A, Takeo M, et al. Inhibition of the dephosphorylation of eukaryotic initiation factor 2α ameliorates murine experimental colitis [J]. Digestion, 2014, 90(3): 167-178.

[17]De Deken X, Corvilain B, Dumont JE, et al. Roles of DUOX-mediated hydrogen peroxide in metabolism, host defense, and signaling [J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(17): 2776-2793.

[18]Harding HP, Zhang Y, Zeng H, et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress [J]. Mol Cell, 2003, 11(3): 619-633.

[19]Geiszt M, Witta J, Baffi J, et al. Dual oxidases represent novel hydrogen peroxide sources supporting mucosal surface host defense [J]. FASEB J, 2003, 17(11): 1502-1504.

[20]Sommer F, Bäckhed F. The gut microbiota engages different signaling pathways to induce Duox2 expression in the ileum and colon epithelium [J]. Mucosal Immunol, 2015, 8(2): 372-379.

[21]Del Vecchio CA, Feng Y, Sokol ES, et al. De-differentiation confers multidrug resistance via noncanonical PERK-Nrf2 signaling [J]. PLoS Biol, 2014, 12(9): e1001945.

[22]Hetz C. The unfolded protein response: controlling cell fate decisions under ER stress and beyond [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(2): 89-102.

[23]Cullinan SB, Diehl JA. PERK-dependent activation of Nrf2 contributes to redox homeostasis and cell survival following endoplasmic reticulum stress [J]. J Biol Chem, 2004, 279(19): 20108-20117.

[24]Rajesh K, Papadakis AI, Kazimierczak U, et al. eIF2α phosphorylation bypasses premature senescence caused by oxidative stress and pro-oxidant antitumor therapies [J]. Aging (Albany NY), 2013, 5(12): 884-901.

(责任编辑：马 军)

Effect of mouse colitis alleviated by Tauroursodeoxycholate on expressions of endoplasmic reticulum stress and dual oxidase2

LIANG Jun1, GAO Qiang2, CUI Meihua1, YU Weidong3, HOU Xiaolin1, YANG Cheng1, LI Xiang4

1.Department of Gastroenterology and Hepatology, Peking University Aerospace School of Clinical Medicine, Aerospace Center Hospital, Beijing 100049; 2.Department of Gastroenterology and Hepatology, the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology; 3.Institute of Clinical Molecular Biology, Peking University People’s Hospital; 4.Animal Center, Peking University People’s Hospital, China

Objective To investigate the effect of Tauroursodeoxycholate (TUDCA), a specific inhibitor of endoplasmic reticulum stress (ERS), which alleviate mouse colitis induced by dextran sulfate sodium (DSS) on the expressions of chaperone proteins of ERS and the dual oxidase2 (Duox2). Methods Seven-week-old C57BL/6J male mice were divided randomly into control group, DSS group, TUDCA treatment group. Mice in the treatment group and inflammation group were used 2.5% DSS to induce colitis. Mice in the treatment group were

500 mg/kg TUDCA by gavage. On 8th day, all mice were sacrificed, the colon tissues were collected, HE staining was used to evaluate pathology of colon, Western blotting and immunohistochemistry (IHC) were used to examine the expressions of proteins including Duox2 and Grp78, Atf6, P-Ire1α/Ire1α, Ire1β, P-Perk/Perk. Results Mice colitis induced by DSS was alleviated by TUDCA. The expressions of Grp78, Duox2, P-Perk/Perk in DSS group were increased, and the expressions of these proteins were down to the level of control in treatment mice. Other proteins were not affected by inflammation or TUDCA. The IHC results were consistent with the results of Grp78 and Duox2 by Western blotting. Conclusion Mouse colitis alleviated by TUDCA could be associated with the inhibition of Grp78-Perk signal pathway, they may be interaction between Duox2 expression and Grp78-Perk signal pathway.

Ulcerative colitis; Endoplasmic reticulum stress; Tauroursodeoxycholate; Dual oxidase2

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.011

国家自然科学基金(81370487)；航天中心医院科研基金(YN201310)

梁君，硕士，研究方向：炎症性肠病。E-mail：daerduo.hi@163.com

崔梅花，博士，主任医师，研究方向：消化疾病的诊治。E-mail：cuimeih@sina.com

R574.62

A

1006-5709(2017)01-0040-05

2016-02-26