巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立和鉴定

张汝钢, 张修礼, 杨云生

1. 解放军总医院海南分院消化科, 海南 三亚 572013; 2. 解放军总医院消化科

巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立和鉴定

张汝钢1, 张修礼2, 杨云生2

1. 解放军总医院海南分院消化科, 海南 三亚 572013; 2. 解放军总医院消化科

目的 建立和鉴定巴马小型猪化脓性肝脓肿模型。方法 采用在肝实质内快速注射金葡菌和自体静脉血凝块混合物的方法建立化脓性肝脓肿模型。采用脓液涂片革兰染色、脓液培养和PCR方法鉴定化脓性肝脓肿的致病菌。采用石蜡切片HE染色法评估化脓性肝脓肿的病理分期。结果 利用金葡菌ATCC 29213和自体静脉血凝块混合物于肝实质内快速注射的方法建立了化脓性肝脓肿模型。脓液涂片革兰染色、脓液培养和PCR结果表明引起化脓性肝脓肿的致病菌为注入的细菌。脓肿石蜡切片HE染色结果表明造模术后第15天为脓肿前期、第21天为脓肿形成期、第33天为脓肿恢复期。结论 首次建立了巴马小型猪化脓性肝脓肿模型。化脓性肝脓肿模型的建立为探讨化脓性肝脓肿的新的治疗模式提供了可能。

金葡菌；巴马小型猪；化脓性肝脓肿

化脓性肝脓肿发病率低，但病情严重、治疗复杂。2009年-2011年解放军总医院化脓性肝脓肿的年住院率是46.6/100 000，治愈率为34.7%，死亡率为1.4%(资料未发表)。因此，有进一步探讨化脓性肝脓肿的新的治疗方式的需要。雄性近交A/J鼠和雄性NZW兔的化脓性肝脓肿模型的建立为探讨化脓性肝脓肿患者的新的治疗模式起到了促进作用[1]。但因动物体积小，解剖结构和生理功能与人类差异大限制其应用。小型猪的解剖结构和生理功能与人类极为相似[2]。化脓性肝脓肿经皮经肝无水乙醇硬化治疗模式的探讨迫切需要小型猪化脓性肝脓肿模型的实验支持[3-4]，然而当前还未建立出稳定的小型猪化脓性肝脓肿模型。研究屠宰场40头猪的弥散性肺病变，发现引起肺脓肿的致病菌主要是金葡菌(8/10)[5]。约克夏小型猪耳缘静脉内滴注金葡菌能够产生稳定的脓毒败血症，接种细菌4～6 h处死解剖发现在肺、脾和肝内均形成了急性微脓肿[6]，由于所形成的肝脓肿为急性微脓肿(6/8)，不适合探讨化脓性肝脓肿的新的治疗模式。我们的研究目的是金葡菌能否引起巴马小型猪化脓性肝脓肿，在注射金葡菌后多长时间是化脓性肝脓肿的脓肿形成期。

1 材料与方法

1.1 巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立广西巴马小型猪30头，雌性9头，雄性21头，体质量21～25 kg，平均体质量(20.9±3.0)kg。按照购买时间和饲养员安置位置的顺序分组。术前1 d禁食，用盐酸氯氨酮和速眠新Ⅱ进行肌肉麻醉，采用上腹部正中切口，用30 ml注射器从脾静脉抽取30 ml静脉血，分14 ml和15 ml量注入2只50 ml灭菌离心管，凝结成血凝块后用无菌剪刀剪切至血凝块能够顺利通过16 G针头，在14 ml静脉血量的离心管内加入1 ml菌液(5×108cfu/ml)[7]，混匀。对照组从右外叶肝游离缘进针，实验组从左外叶肝游离缘进针。食指和中指捏住肝组织和针梗，回抽无血液和胆汁后将细菌和血凝块混合物快速注入肝实质，注射过程中有撕裂感，注射结束后在肝表面见局限性隆起。退针后用吸收性明胶海绵压迫针眼止血。腹壁分三层缝合后将动物送入饲养房。分别于术后第1、2、3、4周处死小型猪并记录观察结果。巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立得到了医院伦理委员会批准。

1.2 巴马小型猪化脓性肝脓肿病源菌的鉴定术前1 d禁食，肌肉麻醉后股动脉放血处死。开腹后暴露肝脏，纵形切开脓肿，取绿豆大脓块涂布载玻片，干燥后进行革兰氏染色，右外叶肝组织涂片作为阴性对照。另取绿豆大脓块置于LB培养基内，37 ℃、200 r/min振荡培养过夜，观察培养基颜色，未加脓块的LB培养基作为阴性对照。取1环量纯培养菌液划线接种于LB琼脂平板，37 ℃静置培养过夜，观察菌落形态，未加菌液的LB培养基作为阴性对照。取3 ml纯培养菌液，4 000×g离心10 min，收集细菌沉淀。采用E.Z.N.A.TM细菌DNA提取试剂盒和溶葡球菌酶(1 U/μl)提取细菌染色质DNA，紫外可见分光光度计定量，去离子水定量为100 ng/μl，置于4 ℃冰箱备用。采用2×Taq PCR MasterMix试剂在PCR仪上扩增，PCR反应合成耐热核酸酶A(nucA)基因的引物参照文献[8]设计。引物序列为5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′(前向)和5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′(反向)。PCR扩增条件为94 ℃，45 s；1循环。94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，60 s；30循环。72 ℃，120 s；1个循环。最后4 ℃保存。扩增产物大小为279 bp，反应体系为50 μl，反应结束后取10 μl扩增产物进行2 %琼脂糖凝胶(含0.5 mg/ml EB)电泳，紫外分析仪照相。阳性对照为金葡菌ATCC 25923和ATCC 29213，阴性对照是用去离子水代替细菌染色质DNA。实验重复3次。

1.4 统计学处理采用SPSS11.5软件进行统计学分析，巴马小型猪化脓性肝脓肿的脓肿大小比较采用单因素方差分析中LSD法进行均值多重比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立采用金葡菌ATCC29213与自体静脉血凝块混合物在肝实质内快速注射的方法对6头巴马小型猪进行化脓性肝脓肿模型的探讨(No.24、25、26、27、28、29)。造模术后不同时间处死取材，发现5头猪(No.24、25、27、28、29)在左外叶肝细菌混合物注射处均存在脓肿，而在右外叶肝均无脓肿形成。脓肿特征：脓腔形成，脓腔内肝组织溶解坏死，溶解坏死的外层为灰黄色脓液，内层为暗红色无定形物(见图1～2)。

细菌与新鲜静脉血混合物注射组(第1组)，脓肿(23.6±14.9)mm2；细菌、肝素钠与新鲜静脉血混合物注射组(第2组)，脓肿(58.7±62.2)mm2；细菌、血凝酶与新鲜静脉血混合物注射组(第3组)，脓肿(141.0±72.1)mm2；细菌与自体脂肪颗粒混合物注射组(第4组)，脓肿(587.0±249.2)mm2；细菌与自体静脉血凝块混合物注射组(第5组)，脓肿(570.2±115.1)mm2。第1组、第2组和第3组之间脓肿大小无显著性差异(P>0.05)，第4组与第5组之间脓肿大小无显著性差异(P>0.05)，第4组与第5组的脓肿大小显著大于第1组、第2组和第3组(P<0.05)。

No.26小型猪无肝脓肿形成。No.21小型猪注射细菌(0.2ml)和自体脂肪颗粒(9ml)混合物后因麻醉意外动物死亡，解剖发现肝实质有裂伤，裂伤大小为300mm2；No.24小型猪处死后在左内叶肝实质内快速注射15ml自体静脉血凝块，解剖发现肝实质有裂伤，裂伤大小为250mm2；No.30小型猪处死后在右内叶肝实质内快速注射15ml生理盐水，解剖发现肝实质有裂伤，裂伤大小为160mm2。

图1 化脓性肝脓肿脓肿面积比较

2.2 巴马小型猪化脓性肝脓肿致病菌的鉴定5头巴马小型猪的化脓性肝脓肿脓块涂布载玻片，干燥后进行革兰染色油镜下观察(No.24、25、27、28、29)，均见到片状分布的革兰染色阳性的葡萄串状球菌(见图2)。肝脓肿脓块在LB培养基内培养过夜，培养基均呈淡黄色均匀混浊；纯培养菌液在LB琼脂平板上分离培养过夜，均形成典型的金葡菌菌落(见图2)。利用金葡菌耐热核酸酶基因A对细菌染色质DNA进行PCR扩增，均出现目的条带(见图3)。提示，引起巴马小型猪化脓性肝脓肿的细菌为注入的细菌，即金葡菌ATCC 29213。

图2 化脓性肝脓肿造模术后不同时间取材、脓肿大小、脓肿块涂片革兰染色和脓块分离培养 A: 35 mm×20 mm(造模术后第7天); B: 32 mm×16 mm(造模术后第14天); C: 32 mm×20 mm(造模术后第21天); D: 27 mm×22 mm(造模术后第33天)。A、E、I: No.27; B、F、J: No.28; C、G、K: No.29; D、H、L: No.24

Fig 2 Different time size, Gram stain and culture of pyogenic hepatic abscess after modeling A: 35 mm×20 mm (7 days after modeling); B:32 mm×16 mm (14 days after modeling); C: 32 mm×20 mm (21 days after modeling); D:27 mm×22 mm (33 days after modeling);A、E、I: No.27; B、F、J: No.28; C、G、K: No.29; D、H、L: No.24

图3 化脓性肝脓肿致病菌PCR鉴定

Fig 3 PCR identification of the pathogenic bacteria of pyogenic hepatic abscess

2.3 巴马小型猪肝脓肿的病理鉴定巴马小型猪化脓性肝脓肿的脓肿组织固定后进行石蜡切片HE染色，

均见到脓肿形成，随着动物生存时间的延长，脓肿壁逐渐形成(见图4)。No.27(7 d)和No.28(14 d)：脓肿中心大片坏死，脓肿壁不明显。No.25(15 d)：脓肿中心大片坏死，纤维组织增生；脓肿壁疏松、不完整。No.29(21 d)：脓肿中心大片坏死，纤维组织增生；脓肿壁疏松、完整。No.24(33 d)：脓肿中心大片坏死，纤维组织增生和毛细血管增生；脓肿壁致密、完整。提示造模术后第7、14、15天病变为脓肿前期，第21天病变为脓肿形成期，第33天为脓肿恢复期。

图4 巴马小型猪化脓性肝脓肿脓块石蜡切片HE染色(100×) A：NO.27，造模术后第7天；B：NO.28，造模术后第14天；C：NO.29，造模术后第21天；D：NO.24，造模术后第33天

Fig 4 Pathological findings of pyogenic hepatic abscess (100×) A: No.27, 7 days after post mortem; B:No.28, 14 days after post mortem; C: No.29, 21 days after post mortem; D: No.24, 33 days after post mortem

3 讨论

挫伤后向前腔系膜静脉内注入金葡菌ATCC 25923不能产生肝脓肿，在肝挫伤区内直接注入细菌不能产生肝脓肿，在肝实质内注入细菌与自体静脉血凝块混合物也不能产生肝脓肿。说明金葡菌ATCC 25923可能不引起巴马小型猪化脓性肝脓肿。在肝挫伤区注入细菌与新鲜静脉血混合物能够产生肝脓肿，但是脓肿体积小，肝素或血凝酶的添加对产生的脓肿大小无明显影响。虽然注射细菌与自体脂肪颗粒混合物能够显著增加脓肿大小，但因脂肪颗粒无液化、脓液干燥无法在超声引导下进行介入治疗。肝挫伤后能够形成局部血肿，但其内淤血和进入的细菌很快被吸收入血进而被清除也许是不产生脓肿的原因[6]。细菌与新鲜静脉血混合后注入肝挫伤区能形成较小的脓肿，说明血液的添加能够延缓细菌进入血循环，使得细菌在局部得以繁殖进而形成脓肿；虽然血凝酶的添加能够促进血液凝结，但血液进入血循环的速度大于血液凝结的速度，可能是血液还未凝结就进入了血循环；肝素的添加不能阻止脓肿形成提示局部血液滞留能够促进脓肿形成；细菌与自体脂肪颗粒混合物注入肝实质，产生了较大的脓肿，说明脂肪颗粒残留能够促进脓肿形成，但因细菌分泌的脂酶活性弱，不能液化脂肪，导致无法在超声引导下进行介入治疗。

在肝实质内注入金葡菌ATCC29213与自体静脉血凝块混合物，产生了稳定的化脓性肝脓肿，脓肿体积大、内含脓液，适合超声引导下介入治疗，说明血凝块的滞留是化脓性肝脓肿形成的关键因素。原因可能与血凝块不被吸收入血有关。因为造模术后不同时间取材，肝脓肿脓液内层均为暗红色无定形物。

虽然在肝实质内注入金葡菌ATCC29213与自体静脉血凝块混合物，能够产生稳定的化脓性肝脓肿，但是肺脓肿的出现频率也高，为60%(3/5)，此时脾、双肾和心瓣膜均未出现脓肿，可能与注入的细菌数量多和肺的细菌负荷量大有关[6]。21、24和30号猪的实验结果表明，肝实质内快速注射自体脂肪颗粒、自体静脉血凝块和生理盐水均能造成肝裂伤，说明单纯的肝实质损伤不能引起肝脓肿，只是形成肝脓肿的必要条件。26号猪造模术后未形成肝脓肿的原因与抽取菌液时菌液未振荡混匀，抽取上清时未抽取到细菌有关。

从化脓性肝脓肿脓块涂片革兰染色、脓块培养和脓块细菌PCR鉴定中，我们发现引起巴马小型猪化脓性肝脓肿的致病菌为注入的细菌，即金葡菌ATCC29213。取材结果发现，在肝实质内注入金葡菌ATCC29213与自体静脉血凝块混合物7 d即能形成肉眼可见的脓肿。但脓肿石蜡切片HE染色结果发现，15 d以内的病变为脓肿前期，21 d的病变为脓肿形成期，33 d的病变为脓肿恢复期。因此，造模术后21 d可能是超声引导下化脓性肝脓肿穿剌置管引流治疗[9]或无水乙醇冲洗治疗[3-4]的最佳时期。

不足之处：巴马小型猪化脓性肝脓肿造模术后肺脓肿出现的频率高可能影响肝脓肿的转归；金葡菌引起的化脓性肝脓肿脓液稠厚，不能用介入穿剌针(18 G×200 mm)抽出可能为探讨化脓性肝脓肿的新的治疗模式带来了困难；金葡菌ATCC25923不能产生肝脓肿的原因尚需深入研究。

总之，采用金葡菌ATCC29213和自体静脉血凝块混合物于肝实质内快速注射的方法能够建立稳定的巴马小型猪化脓性肝脓肿模型，造模术后21 d为脓肿形成期[10]。抽取金葡菌菌液前菌液彻底混匀、自体静脉血充分凝结及细菌血凝块混合物于肝实质内注射时速度快是化脓性肝脓肿形成的必要条件。巴马小型猪化脓性肝脓肿模型的建立为探讨化脓性肝脓肿的新的治疗模式[3-4]提供了可能。

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(责任编辑：王全楚)

Establishment and identification of pyogenic hepatic abscess in Bama minipig

ZHANG Rugang1, ZHANG Xiuli2, YANG Yunsheng2

1.Department of Gastroenterology, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 572013; 2.Department of Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital, China

Objective To establish and identify pyogenic hepatic abscess in Bama minipig.Methods Pyogenic hepatic abscess was established by injecting the mixture of S.aureus and self venous blood clot in liver parenchyma. Pathogenic bacterium was identified by the way of Gram’s stain, bacterial culture and PCR amplification methods, and pathological identification was performed by the way of stained paraffin section.Results Pyogenic hepatic abscess was successfully established by rapidly injecting the mixture of S.aureus ATCC 29213 and self venous blood clot in liver parenchyma. The pathogenic bacterium was S.aureus ATCC 29213. The abscess prophase was found after 15th day, the abscess-formation stage after 21st day and the abscess recovery phase after 33rd day of the operation.Conclusion Pyogenic hepatic abscess in Bama minipig was firstly established and identified, which will help in the studies of new treatment methods of pyogenic hepatic abscess.

S.aureus; Bama minipig; Pyogenic hepatic abscess

全军“十一五”重大专项课题资助(08Z037)；中国博士后科学基金第47批面上资助(20100471817)

张汝钢，副主任医师,研究方向：内窥镜下消化道病变的微创治疗。E-mail: zrg026@163.com

杨云生，主任医师，博士生导师,研究方向：肠道微生态及疾病、内镜新技术。E-mail: sunny301ddc@126.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.018

R575.4

A

1006-5709(2017)01-0066-04

2016-04-28