受体IL-28B基因多态性对肝移植术后丙型肝炎复发抗病毒治疗及预后的影响

周双男, 张 宁, 刘振文, 李洪苓, 王 琳, 苏海滨, 高银杰, 周 霞, 张 敏

解放军第302医院 1.肝移植中心; 2.中西医结合肝病中心,北京 100039

受体IL-28B基因多态性对肝移植术后丙型肝炎复发抗病毒治疗及预后的影响

周双男1, 张 宁2, 刘振文1, 李洪苓1, 王 琳1, 苏海滨1, 高银杰1, 周 霞1, 张 敏1

解放军第302医院 1.肝移植中心; 2.中西医结合肝病中心,北京 100039

目的 探讨受体白介素28B(interleukin-28B, IL-28B)基因多态性对肝移植术后丙型肝炎复发抗病毒治疗及预后的影响。方法 对33例肝移植术后丙型肝炎复发患者进行干扰素联合利巴韦林抗病毒治疗，并通过肝组织进行受体IL-28B rs12979860位点的基因多态性检测，观察病毒学应答及预后情况。结果 33例患者获得治疗结束时病毒学应答(end of treatment virologic response, ETVR) 24例(72.7%)，其中获得持续性病毒学应答(sustained virologic response, SVR)12例(36.4%)。受体的基因型分布：CC型25例(75.8%)、非CC型8例(24.2%)。CC型与非CC型患者中ETVR率分别为84.0%、37.5%，SVR率分别为44.0%、12.5%，二者比较,CC型获得ETVR率较高(P<0.05)，SVR率差异无统计学意义(P>0.05)；CC型及非CC型患者中抗病毒治疗后移植肝硬化率分别为8.0%、50.0%，二者比较,CC型患者移植肝硬化率较低(P<0.05)。结论 受体IL-28B rs12979860位点CC基因型可能对移植术后丙型肝炎复发患者抗病毒治疗效果及预后存在有利影响。

IL-28B基因多态性;肝移植;丙型肝炎;抗病毒治疗

肝移植术是治疗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染相关终末期肝病的有效方法，但移植术后丙型肝炎复发十分普遍，且复发患者肝损伤的进展较非移植患者人群明显增快[1-2]，5年内移植物功能衰竭发生率约为10%[3]。有效的抗病毒治疗可阻止或延缓疾病进展[4]。已有研究[5-6]证明白细胞介素-28B(interleukin-28B,IL-28B)基因多态性是HCV清除及应用干扰素(interferon,IFN)治疗获得病毒学应答的强有力预测因素，对肝移植术后患者来讲，供受体的IL-28B基因背景可能在移植术后丙型肝炎复发及其抗病毒治疗中扮演着重要角色。本文就2004年6月-2014年6月于解放军302医院行肝移植治疗的33例肝移植术后丙型肝炎复发患者的抗病毒治疗及其受体IL-28B rs12979860位点的基因多态性检测进行分析研究，旨在了解其对肝移植术后丙型肝炎复发抗病毒治疗及预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料2004年6月-2014年6月我中心共收治移植术后HCV复发患者59例，其中33例患者行抗病毒治疗，男25例，女8例，年龄21～66岁，平均年龄(52.42±9.18)岁。33例HCV相关终末期肝病患者均行原位经典肝移植术，术前患者均签署知情同意书，符合医学伦理学规定。移植术后HCV RNA阳性，肝脏穿刺病理组织检查证实丙型肝炎复发，排除排斥反应、胆管并发症、药物性肝损伤、合并其他病毒感染等常见移植术后并发症。

1.2 抗病毒治疗方案采用IFN联合利巴韦林小剂量递增方案进行抗病毒治疗。根据患者耐受情况，IFN及利巴韦林由初始低用量(IFN初始剂量90万单位/次、隔日1次，利巴韦林初始用量600 mg/d)，如患者能够耐受治疗，则每2周增加药物剂量1次，逐渐过渡至标准剂量的长效干扰素(聚乙二醇干扰素α-2a)联合利巴韦林治疗，以达到患者最大耐受剂量或标准治疗剂量。治疗过程中，根据临床需要给予粒细胞集落刺激因子及促红细胞生成素对症处理。如患者出现重度排斥反应、严重感染、严重精神症状、贫血等不良反应及其他不可控制的并发症，则终止抗病毒治疗。预期抗病毒疗程：HCV RNA基因1b型为48周，基因2a型为24周。

1.3 抗病毒治疗分组标准治疗组：聚乙二醇干扰素α-2a增加至180 μg/周，利巴韦林900～1 200 mg/d，治疗时间基因1型为48周，基因2型为24周。足疗程组：干扰素及利巴韦林剂量未能达到标准治疗剂量，但完成了24周或48周疗程。不完全治疗组：IFN及利巴韦林剂量未能达到标准治疗剂量，且未能完成24周或48周疗程。疗程从应用IFN之时间起算。

1.4 免疫抑制方案所有患者在移植术后早期给予皮质激素+钙调磷酸酶抑制剂(他克莫司)+吗替麦考酚酯三联免疫抑制方案，激素在移植术后3个月内停用。3个月后根据患者情况，单独使用他克莫司或联合使用吗替麦考酚酯，根据他克莫司血药浓度调整免疫抑制剂用量。

1.5 观察指标采用RT-PCR检测治疗前后血清HCV RNA载量，HCV RNA最低检测值为100 IU/ml；采用线性探针杂交法进行HCV基因型分析。观察治疗结束时病毒学应答(end of treatment virologic response,ETVR,治疗结束时HCV RNA低于可检测水平)、持续病毒学应答(sustained virologic response,SVR),抗病毒疗程结束24周后血清HCV RNA低于可检测水平)及治疗后截止最后1次随访时患者有无移植肝硬化(移植后肝脏病理提示4期肝纤维化或出现伴有或不伴有外周水肿的腹水、胸腔积液、上消化道静脉曲张出血、自发性腹膜炎、肝性脑病等失代偿期肝硬化临床表现)。

1.6 主要试剂和仪器石蜡包埋组织基因组提取试剂盒(北京天根生物)；低温台式离心机(Eppendorf)；PTC-200 PCR仪(BIO-RAD)；DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂)；UV-IV紫外分析仪(北京市新技术应用研究所)；真空抽滤泵(Millipore)。

1.7 受体IL-28B基因多态性测定采用石蜡包埋组织基因组提取试剂盒提取石蜡包埋组织基因组DNA，按照说明书进行操作。琼脂糖凝胶电泳鉴定提取基因组DNA。通过NCBI查找rs12979860的序列，并用Primer 5.0 引物设计软件进行引物设计，PCR法扩增rs12979860。rs12979860上游引物为5′-GCTTATCGCATACGGCTAGG-3′，下游引物为5′-AGGCTCAGGGTCAATCACAG-3′。直接对PCR扩增产物进行测序对上述位点进行检测。直接测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。

2 结果

2.1 一般情况抗病毒治疗前HCV RNA载量为8.2×104～5.8×108IU/ml。基因1b型28例，2a型5例。抗病毒治疗开始时间为移植术后2～60个月，平均时间16.6个月。随访时间16～129个月,平均随访时间75.7个月。

2.2 抗病毒疗效33例患者中共获得ETVR 24例，其中12例获得SVR。17例因不良反应提前终止治疗，未完成既定疗程。提前终止抗病毒治疗的原因包括：中性粒细胞严重减少4例，排斥反应3例，胆管并发症3例，中度以上贫血2例，感染2例，极度乏力1例，皮肤瘙痒1例，皮疹1例。

2.3 受体IL-28B rs12979860位点基因型分布及其与抗病毒疗效及患者预后之间的关系33例患者受体的IL-28B基因型分布：CC型25例(75.8%)、非CC型8例(24.2%)。CC基因型患者ETVR率高于非CC基因型，差异有统计学意义(P<0.05);二者SVR率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；CC型患者经抗病毒治疗后有2例出现移植肝硬化，而在非CC基因型患者中出现4例，差异有统计学意义(P<0.05)。不同基因型在患者年龄、性别、治疗前病毒载量分布、病毒基因型分布、抗病毒治疗分组、随访时间等比较，差异无统计学意义(P>0.05, 见表1)。

表1 IL-28B不同基因型分布特点与抗病毒疗效及患者预后之间的比较

Tab 1 Comparison of the distribution characteristics of IL-28B genotypes and the antiviral efficacy and prognosis of the patients

注：治疗前病毒载量按照≥或<1×106 IU/ml分组；抗病毒治疗分组按照标准治疗/足疗程/不完全治疗进行分组。

3 讨论

不同研究对于肝移植术后丙型肝炎复发抗病毒治疗的影响因素结论不同，有研究[7]表明获得早期病毒学应答(RVR)、治疗前HCV RNA载量、HCV RNA基因型、抗病毒药物的剂量及疗程均是影响疗效的重要因素[9-10]。针对IL-28B基因多态性对丙型肝炎抗病毒疗效的预测作用也是近年兴起的研究热点之一。

IL-28B即IFN-λ3，是2003年国际人类基因组组织新发现的IFN家族的一员[8]。目前已经明确IL-28B在体内和体外都具有免疫调节和抗病毒效能，并且可以促进IFN-α的产生，在感染HCV患者的肝脏活组织样本中能发现IL-28B mRNAs的存在[9]。目前已有报道IL-28B的基因多态性与抗HCV疗效及病情进展有一定相关性，其中对位于染色体19的IL-28B 基因上游3 kb处的rs12979860位点研究较多，学者将不同的IL-28B相关的基因型称为保护性和非保护性基因型，对于rs12979860来说，CC型为保护性基因型，CT型或TT型(非CC型)为非保护性基因型[10]，保护性基因型即CC型的患者可以获得较好的干扰素抗病毒应答率[5,11]。

相对于非移植人群，针对IL-28B的基因多态性在肝移植后人群中的作用目前研究较少。对于非移植丙型肝炎人群，Stättermayer等[5,12]的研究发现，IL-28B保护性基因型与较高的基线病毒载量水平相关。然而，Thompson等[13]的研究发现，IL-28B基因型在不同HCV RNA载量组的分布没有差别。在本组研究中CC基因型及非CC基因型在患者治疗前病毒载量分布差异无统计学意义，但移植术后患者均长期应用免疫抑制剂，药物对病毒载量的影响是否会影响IL-28B基因型在不同病毒载量的分布仍需要进一步的研究。另外因不同的随访时间、HCV RNA基因型、抗病毒药物的剂量及疗程等均是可能影响疗效及预后的因素[7]，故本组研究在不同IL-28B基因型组别中对上述指标进行分析，结果显示差异无统计学意义，提示数据具有可比性。

进一步对本组病例中CC基因型及非CC基因型患者的抗病毒疗效及患者预后进行比较发现，CC基因型患者出现移植肝硬化率低于非CC基因型患者(8.0%vs50.0%)，提示与非CC基因型患者相比，CC基因型肝移植术后丙型肝炎复发患者预后较好，与其他报道结果相符[13-14]。欧美国家有研究[15-17]表明受体CC基因型患者可获得较高SVR率，提示受体IL-28B的基因多态性对移植术后丙型肝炎抗病毒治疗中有着较强的预测作用。本组研究结果显示相对于非CC基因型，CC基因型患者获得ETVR率较高，可能对抗病毒治疗存在有利影响；但在获得SVR率上，CC基因型患者虽高于非CC基因型患者，但二者差异无统计学意义，与上述研究结论不符，一方面考虑与肝移植术后患者对IFN联合利巴韦林的抗病毒方案耐受性较差，有相当比例的患者不能完成标准剂量和疗程的治疗，导致总体抗病毒疗效较差；另一方面考虑与rs12979860在中国人群中不同基因型分布与欧美人群分布特点不同或样本量偏小有关，如果在后续的研究中进一步增大样本量，提高检验效能，将有可能得出与欧美人群相同的结果。另外,遗憾的是本组研究未能获得供体的IL-28B基因型信息，因此移植术后供受体IL-28B优势基因和劣势基因的不同组合对于移植术后HCV复发转归和抗病毒疗效的影响尚不能明确，如能在下一步研究中将供受体IL-28B基因多态性一起纳入分析进行研究，将可能得出更令人信服的结论。

综上所述，对于肝移植术后丙型肝炎复发患者，受体IL-28B CC基因型可获得抗病毒治疗更高的ETVR率，减少移植肝硬化发生率，可能对抗病毒治疗效果及预后存在有利影响。针对IL-28B基因多态性在肝移植术后丙型肝炎复发患者中的作用仍需要进一步深入研究。

[1]Brown RS. Hepatitis C and liver transplantation [J]. Nature, 2005, 436(7053): 973-978.

[2]Ponziani FR, Gasbarrini A, Pompili M, et a1. Management of hepatitis C virus infection recurrence after liver transplantation: an overview [J]. Transplant Proc, 2011, 43(1): 291-295.

[3]Heneghan MA. Long-term outcome of hepatitis C infection after liver transplantation [J]. N Engl J Med, 1996, 335(7): 522.

[4]Selzner N, Renner EL, Selzner M, et al. Antiviral treatment of recurrent hepatitis C after liver transplantation: predictors of response and long-term outcome [J]. Transplantation, 2009, 88(10): 1214-1221.

[5]Ge D, Fellay J, Thompason AJ, et al. Genetic variation in IL 28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance [J]. Nature, 2009, 461(7262):399-401.

[6]McCarthy JJ, Li JH, Thompson A, et a1. Replicated association between an IL28B gene variant and a sustained response to pegylated interferon and ribavirin [J]. Gastroenterology, 2010, 138(7): 2307-2314.

[7]Ghany MG, Nelson DR, Strader DB, et al. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases [J]. Hepatology, 2011, 54(4): 1433-1444.

[8]Sheppard P, Kindsvogel W, Xu W, et al. IL-28, IL-29 and their class Ⅱ cytokine receptor IL-28R [J]. Nat Immunol, 2003, 4(1): 63-68.

[9]O’Brien TR. Interferon-alfa, interferon-lambda and hepatitis C [J]. Nat Genet, 2009, 41(10): 1048-1050.

[10]Thomas DL, Thio CL, Martin MP, et al. Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus [J]. Nature, 2009, 461(7265): 798-801.

[11]Honda M, Sakai A, Yamashita T, et a1. Hepatic ISG expression is associated with genetic variation in interleukin 28B and the outcome of IFN therapyfor chronic hepatitis C [J]. Gastroenterology, 2010, 139(2): 499-509.

[12]Stättermayer AF, Stauber R, Hofer H, et a1. Impact of IL28B genotype on the early and sustained virologic response in treatment-naïve patients with chronic hepatitis C [J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2011, 9(4): 344-350, e2.

[13]Thompson AJ, Muir AJ, Sulkowski MS, et a1. Interleukin-28B polymorphism improves viral kinetics and is the strongest pretreatment predictor of sustained virologic response in genotype 1 hepatitis C virus [J]. Gastroenterology, 2010, 139(1): 120-129, e18.

[14]Ackefors M, Nyström J, Wernerson A, et al. Evolution of fibrosis during HCV recurrence after liver transplantation-influence of IL-28B SNP and response to peg-IFN and ribavirin treatment [J]. J Viral Hepat, 2013, 20(11): 770-778.

[15]Graziadei IW, Zoller HM, Schloegl A, et al. Early viral load and recipient IL28B rs12979860 genotype are predictors for progression of hepatitis C after liver transplantation [J]. Liver Transpl, 2012, 18(6): 671-679.

[16]Gerlei Z, Sárváry E, Lengyel G, et al. Measurement and clinical significance of interleukin 28B in hepatitis C virus-infected liver transplant patients [J]. Transplant Proc, 2012, 44(7): 2154-2156.

[17]Coto-Llerena M, Pérez-Del-Pulgar S, Crespo G, et al. Donor and recipient IL 28B polymorphisms in HCV-infected patients undergoing antiviral therapy before and after live transplantation [J]. Am J Transplant, 2011, 11(5): 1051-1057.

(责任编辑：王全楚)

Influence of recipient IL-28B polymorphisms in recurrent hepatitis C patients after liver transplantation on the antiviral therapy and prognosis

ZHOU Shuangnan1, ZHANG Ning2, LIU Zhenwen1, LI Hongling1, WANG Lin1, SU Haibin1, GAO Yinjie1, ZHOU Xia1, ZHANG Min1

1.Liver Transplantation Center; 2.Liver Disease Center of Integrated Traditional Chinese Medicine and Western Medicine, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

Objective To investigate the influence of recipient interleukin-28B (IL-28B) polymorphisms on the antiviral therapy and prognosis in patients with hepatitis C recurrence after liver transplantation.Methods Thirty-three patients with hepatitis C recurrence after liver transplantation were treated with interferon combined with Ribavirin. IL-28B polymorphisms (rs12979860) was characterized using liver tissue from recipients. Virological response and prognosis were observed.Results Twenty-four (72.7%) patients achieved ETVR, in who 12 cases (36.4%) achieved SVR. The prevalence of CC genotype and non-CC genotype in recipient samples were 75.8% and 24.2%, respectively. The rate of ETVR (84.0%) in patients with CC genotype was higher than the rate in patients with non-CC genotype (37.5%) (P<0.05). The difference of SVR rates between the CC genotype (44.0%) and non-CC genotype (12.5%) was not statistically significant (P>0.05). The rate of transplanted liver cirrhosis after antiviral therapy in patients with genotype CC (8.0%) was lower than the rate in patients with non-CC genotype (50.0%) (P<0.05).Conclusion The recipient CC genotype of IL-28B (rs12979860) may have beneficial influence on antiviral therapy and prognosis in patients with hepatitis C recurrence after liver transplantation.

IL-28B polymorphisms; Liver transplantation; Hepatitis C; Antiviral therapy

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.020

2013年解放军第302医院院长创新基金(YNKT2013021)；2014年解放军第302医院院长创新基金(YNKT2014021)

周双男，主治医师，在读博士研究生，研究方向：肝病及肝移植的临床诊疗与研究。E-mail：13121690661@163.com

张敏，副主任医师，博士，研究方向：肝病的临床诊疗与研究。E-mail：13911517721@163.com

R575.1

A

1006-5709(2017)01-0074-04

2016-02-03