富硒甘薯粗硒多糖聚酰胺柱层析工艺

于 鹏，王奕文，段宝鑫，薛友林，谷学军*

(1辽宁大学 稀散元素化学研究所，辽宁 沈阳110036；2辽宁大学 轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036)

0 引言

硒是人体所需的必不可少的稀有元素，研究证明硒具有提高免疫力、抗氧化、抗肿瘤等功能[1，2].多糖是一种至少有10种单糖通过糖苷键连接而成的多聚糖[3，4].将硒与多糖有机结合后形成硒多糖，其抗氧化、抗肿瘤的效果会更好.在分离纯化硒多糖的过程中，甘薯内棕色色素会加深硒多糖溶液体系的颜色，污染纤维素阴离子交换柱的填料；甘薯内存在大量的蛋白质，蛋白质会挂在阴离子交换层析柱的填料上，影响硒多糖的纯化，所以应尽可能脱除甘薯粗硒多糖内的蛋白质[5].

传统的Sevag法是使用氯仿和正丁醇协同作用达到脱蛋白的效果[6]，此方法所使用的化学试剂对环境有一定的污染.而聚酰胺对环境无污染并可重复使用，所以本实验使用聚酰胺为填料的柱层析方法脱除色素和蛋白质，使用单因素考察法探究脱色和脱蛋白的工艺参数.

1 材料和方法

1.1 实验材料

植物材料：甘薯(sweet potato)由华实生态实验基地以1 mg/mL的亚硒酸钠自主人工生物施硒法培育而成.

主要试剂：无水乙醇、考马斯亮蓝G-250、重蒸苯酚、浓硫酸、牛血清蛋白、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、聚酰胺.

主要仪器：真空冷冻干燥机、旋转蒸发仪，中压玻璃层析柱(25 mm×600 mm).

1.2 粗多糖的提取

自主培育的富硒甘薯→清洗干净→切成薄片→鼓风干燥箱内烘干→粉碎机粉碎→过60目筛→石油醚回流脱脂→抽滤→浸提3 h→离心浸提液30 min→收集上清液→浓缩至原体积的1/5→乙醇沉淀(保证体系乙醇浓度为75%)→离心醇沉液30 min→收集沉淀→丙酮和无水乙醇反复洗涤三次→复溶→蒸馏水回流透析48 h→真空冷冻干燥→甘薯粗硒多糖.

1.3 粗硒多糖的脱色与脱蛋白的单因素实验

工艺流程：复溶后的粗硒多糖→加入到聚酰胺层析柱中→调节流速→自动部分收集器收集过滤后的样品→浓缩；

本实验最佳上样量的确定：分别取5份甘薯粗硒多糖溶液，固定上样体积为75 mL，上样量为150、300、450、600、750 mg，吸附时间为30 min，洗脱速率为3 mL/min；最佳上样体积的确定：分别取3份甘薯粗硒多糖溶液，固定上样量为600 mg，上样体积分别为60、75、90 mL，吸附时间为30 min，洗脱速率为3 mL/min；最佳吸附时间的确定：分别取5份甘薯粗硒多糖溶液，固定上样量为600 mg，上样体积为75 mL，吸附时间分别为5、10、20、30、60 min，洗脱速率为3 mL/min.最佳洗脱速率的确定：分别取5份甘薯粗硒多糖溶液，固定上样量为600 mg，上体积为75 mL，吸附时间为30 min，洗脱速率分别为1.5、3、4.5、6、9 mL/min.

1.4 脱色率的检测

取甘薯粗硒多糖样品复溶后，与紫外分光光度计在200～800 nm进行全波长扫描，在可见光区选择最大吸收峰的波长即为检测波长.计算公式为：脱色率(%)=(脱色前的吸光度-脱色后的吸光度)/脱色前的吸光度×100%.

1.5 多糖保留率的检测

采用苯酚-硫酸法测脱色脱蛋白前后的总糖含量，苯酚-硫酸法的具体步骤如下：取固体苯酚5 g于棕色容量瓶内，定容至100 mL后水浴加热，使苯酚充分溶解，配成5%的苯酚，放到4 ℃恒温内保存.精确称取5 mg充分烘干后的分析纯D-无水葡萄糖标准品定容至50 mL配成0.1 mg/mL的葡萄糖标准液，并存放于4 ℃的环境内保存.吸取葡萄糖标准液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于相应的具塞试管中，用超纯水补齐至0.5 mL，依次分别加入0.5 mL 5%的苯酚，然后迅速加入2.5 mL 98%的浓硫酸，40 ℃水浴30 min后放置室温.在490 nm处测吸光度，并绘制葡萄糖标准曲线，如图1所示.利用公式y=10.56x+0.011 2计算总糖含量，多糖保留率(%)=脱蛋白后的多糖含量/脱蛋白前的多糖含量×100%.

1.6 蛋白质脱除率的检测

采用考马斯亮蓝G-250法测定甘薯粗硒多糖的蛋白质含量，考马斯亮蓝G-250法的具体方法如下：精确称取考马斯亮蓝G-250标准品100 mg溶于50 mL 95%的乙醇中，随后加入100 mL 85%的磷酸，最后用蒸馏水稀释至1 000 mL，配成0.01%的考马斯亮蓝试剂并在4 ℃下存于棕色瓶中备用.精确称取标准牛血清蛋白10 mg并定容至100 mL的容量瓶内，配置0.1 mg/mL的标准牛血清蛋白溶液并存放于4 ℃的环境内备用.分别精确吸取蛋白质标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞试管中，分别加入蒸馏水，将体系补齐至1 mL，加入考马斯亮蓝G-250溶液5 mL混匀，放置10 min，并于595 nm处测其吸光度并绘制标准蛋白质曲线，如图2所示.利用公式y=5.205x+0.099 3测蛋白质浓度，蛋白质的脱除率(%)=(脱蛋白前的吸光度-脱蛋白后的吸光度)/脱蛋白前的吸光度×100%.

图1 葡萄糖标准曲线

图2 标准蛋白质曲线

2 单因素实验结果分析

2.1 上样量的影响

根据图3分析得知，当固定上样体积为75 mL，吸附平衡时间为30 min，洗脱速率为3 mL/min时，伴随着上样量逐渐增加的同时，总糖保留率呈递增趋势，而脱色率和脱蛋白呈微小递减趋势.理想效果是总糖保留率高而脱色和脱蛋白率也高.综上因素，选择甘薯硒多糖的上样量为600 mg.

2.2 上样体积的影响

根据图4分析得知，当固定上样量为600 mg，洗脱时间为30 min，吸附平衡速率为3 mL/min时，随着上样体积的不断升高，脱色率、脱蛋白率和总糖保留率没有显著的变化，上样体积大会增加含糖具塞试管的数量，同时会增加后期浓缩操作的误差.综上因素，选择甘薯硒多糖的上样体积为60 mL(2/5倍柱体积).

图3 上样量的影响

图4 上样体积的影响

2.3 吸附平衡时间的影响

根据图5分析得知，当固定上样量为600 mg、上样体积为75 mL、洗脱速率为3 mL/min时，随着吸附平衡时间的增加，总糖保留率在5～20 min区间内呈递减趋势，而脱色率和脱蛋白率在5～20 min内呈递增趋势，20 min以后，总糖保留率、脱色率、脱蛋白率均没有显著的变化.为确保总糖保留率、脱色率和脱蛋白率高，综上因素，选择甘薯硒多糖的吸附平衡时间为20 min.

2.4 洗脱速率的影响

根据图6分析得知，当固定上样量为600 mg、上样体积为75 mL、吸附平衡时间为30 min时，随着脱色速率的提高，总糖保留率持续上升，而脱色率和脱蛋白率逐渐下降.为确保总糖保留率、脱色率和脱蛋白率，综上因素，选择甘薯硒多糖的洗脱速率为4.5 mL/min.

图5 吸附平衡时间的影响

图6 洗脱速率的影响

3 讨论

综上研究，选择上样量为600 mg、上样体积为60 mL(2/5倍柱体积)、吸附平衡时间为20 min、洗脱速率为4.5 mL/min为本实验的工艺参数时，其脱色率为85.5%、脱蛋白率76.2%、总糖保留率68.2%.由于硒多糖的生物活性可决定其抗氧化和抗肿瘤的活性[7]，因此最大程度的保护甘薯硒多糖活性不被破坏并绿色环保，是聚酰胺柱层析法脱蛋白工艺研究的目的所在.