超声协同吡罗昔康对牛血清白蛋白的损伤研究

刘 彬，董浩博，王冬晶，姚路扬，翁玉欣，付林玉，杨微微，徐 淼

(1.辽宁大学 药学院，辽宁 沈阳 110036；2.北京利龄恒泰药业有限公司，北京 102205)

0 引言

肿瘤是威胁人类健康最凶险的疾病之一.目前，对于肿瘤的治疗手段主要是抗肿瘤药物的联合化疗、放疗和手术治疗等，但是这些治疗手段都或多或少存在着一定的缺陷，对于正常细胞的损伤是人们不能无视的副作用[1].所以，寻找选择性更好，副作用更小的治疗肿瘤的新方法，始终是当今医学研究的热点.

自1975年，Kelly和Snell应用光动力疗法首次治疗膀胱癌的研究报道之后[2]，光动力学疗法在众多肿瘤的治疗过程中相继开展.由于光在人体组织中的穿透性不好，使得光动力治疗肿瘤主要集中在人体的表面，无法对于深层的肿瘤起到有效的作用[3，4]，为了克服光动力疗法治疗肿瘤的局限性，利用超声抗肿瘤已成为研究热点之一.超声波具有穿透性强、无创伤性且操作简便等特点，作为激发源有望克服光动力治疗存在的诸多局限性.因此，一种利用超声激活癌细胞内富集的声敏剂，导致肿瘤细胞不可逆性损伤的新型治疗癌症的声动力学疗法近年来引起众多研究人员的关注[5，6].然而，目前相关报道多以肿瘤细胞为研究对象，通过损伤细胞膜使肿瘤细胞坏死来达到治疗肿瘤的目的[7].由于正常组织细胞膜和癌症细胞膜之间的差别较小，因此，抑制和杀死肿瘤细胞应以供给具有各种功能而且容易使药物具有靶向性的生物大分子为目标[8，9].众所周知，蛋白质具有多种生理功能，如果被损伤，则无法完成重要功能，进而达到抑制肿瘤细胞生长的目的.白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，而牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HSA)有70%以上的同源性，因此BSA常代替HSA被选作模型蛋白[10].

图1 吡罗昔康结构示意图

本课题组前期研究发现[11]，替诺昔康具有一定的声敏性，为了开发更多声敏剂，本文在此基础上进一步考察了另一种非甾体抗炎药吡罗昔康(PIR，结构式见图1)的声敏性.考察了药物浓度和超声时间对PIR协同超声损伤BSA的影响，并探讨了作用机制，该项研究为推动分子水平的声动力疗法研究提供了有意义的参考.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

KQ5200DB型数控超声反应器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-2100型双光束紫外/可见分光光度计(北京瑞丽分析仪器公司)；F-7000型荧光光度计(日本日立公司)；PIR(兰明科技有限公司)；BSA(北京奥博星生物技术责任有限公司)；二苯卡巴肼(DPCI)、叠氮化钠(NaN3)、抗坏血酸(Vc)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)及L-组氨酸(L-His)均购置于国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为市售分析纯，实验用水为双蒸水.

1.2 实验方法

1.2.1 超声结合PIR对BSA的损伤研究

取6个25 mL容量瓶标记为a～f，分别向其中加入10 mL浓度为2.5×10-5mol/L的BSA溶液，向b～f中加入不同体积浓度为1.0×10-4mol/L的PIR储备液，用NaCl-Tris-HCl缓冲液稀释至刻度，使PIR的浓度分别为0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5×10-5mol/L.将上述溶液平均分成两份置于50 mL锥形瓶中，一份在放入频率为400 kHz的超声装置中，调节温度为37 ℃，功率为50 W，超声照射，另一份暗处放置.3 h后取样，分别测定荧光光谱，激发波长280 nm，狭缝均为5 nm，扫描的波段范围200～800 nm.此外，取5个25 mL容量瓶，同前文所述，使溶液中BSA浓度为1.0×10-5mol/L，PIR浓度为0.6×10-5mol/L，考察时间因素对BSA损伤作用的影响.

1.2.2 BSA损伤机制研究

取6个10 mL容量瓶标记为a～f，向其中分别加入2 mL浓度为2.5×10-2mol/L的DPCI溶液，b～f中加入不同体积浓度为1.0×10-4mol/L的PIR储备液，用NaCl-Tris-HCl缓冲液稀释至刻度，使PIR的浓度分别为0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5×10-5mol/L.转移至50 mL锥形瓶中调节温度为37 ℃，功率为50 W，超声照射.1.0 h后转移至分液漏斗中用苯-四氯化碳萃取剂萃取，定容至10 mL.用萃取剂作参比，在563 nm处测吸光度A样，暗处放置样品吸光度A对照作空白，以ΔA=(A样-A对照)表示活性氧相对产生量.然后，参照上述操作，固定溶液中PIR浓度为0.6×10-5mol/L，分别考察超声时间为0，15，30，45，60，75 min及猝灭剂(NaN3、Vc、L-His、BHT)因素对活性氧产量及种类的影响.

2 结果与讨论

2.1 超声结合PIR对BSA的损伤

2.1.1 PIR浓度对超声协同PIR损伤BSA的影响

图2 PIR浓度改变对超声协同PIR损伤BSA的影响

从图2可以看出，随着PIR浓度的增加，无论有无超声照射，BSA在340 nm处的荧光均被猝灭，说明PIR损伤BSA具有浓度依赖性.并且，经超声协同PIR作用后，任一浓度条件下BSA的猝灭程度均大于无超声照射组，证明超声加剧了PIR对BSA的损伤作用.但是，其加剧程度并不与PIR浓度的增大而增加，当浓度达到0.9×10-5mol/L后对BSA的损伤程度不再进一步增大.有文献报道，BSA内源荧光来自于分子中色氨酸残基和酪氨酸残基[12]，因此可推断上述现象的出现应该与氨基酸残基逐渐被破坏，不再具有荧光性有关.

2.1.2 照射时间对PIR联合超声损伤BSA的影响

图3 时间因素对超声协同PIR损伤BSA的影响

从图3中可以看出，无论有无PIR存在，随着超声照射时间的延长，BSA荧光强度均呈下降趋势，说明超声照射时间的延长加剧了BSA分子中可产生荧光的氨基酸残基破坏程度，使其不再具有荧光性，从而导致BSA荧光强度随之降低.特别是当超声与PIR协调作用后，BSA的荧光发生更加明显的淬灭现象.这说明随着超声时间延长，更多PIR被激活，进而导致更多的产荧光氨基酸残基被破坏.此外，从图中亦可看出，在超声初期BSA损伤最为明显，随着超声时间进一步延长，尽管BSA被进一步损伤，但程度趋于平缓.

2.2 活性氧的鉴定

本实验利用二苯卡巴肼(DPCI)可捕获光敏剂产生的活性氧，生成二苯卡巴腙(DPCO)，用有机溶剂萃取后DPCO在563 nm处有强吸收的机理检测体系中活性氧产量[13].

2.2.1 PIR浓度对活性氧生成的影响

图4 PIR浓度对活性氧产量的影响

图4为不同浓度PIR在超声照射1h后，萃取液中DPCO的吸光度情况.由图中可见，当PIR浓度在0.9×10-5mol/L以下时，活性氧的产量随着PIR浓度增大而增加；当浓度超过0.9×10-5mol/L时，活性氧的产量则随着浓度的增大而下降.这一现象可能是因为当药物浓度过大时，减弱了光的传播，影响声致发光作用效果，导致PIR不能有效利用声能，从而使活性氧的产量下降，该结果与前文PIR浓度因素对BSA损伤效果相一致.

2.2.2 超声照射时间对活性氧产量的影响

图5 超声照射时间对活性氧产量的影响

从图5可知，无超声条件下，加药组与空白组均有少量的活性氧存在，但其产量并不随放置时间延长而改变.当对PIR+BSA混合体系进行超声照射后，体系中活性氧产量随时间的延长明显增大，并且照射时间大于30 min后，其增加幅度远大于空白组，说明PIR不仅具有良好的声敏性，且与照射时间有依附性.

2.2.3 活性氧种类的鉴定

图6 不同活性氧猝灭剂对体系中活性氧产量的影响

图6反映了加入不同活性氧猝灭剂Vc、BHT、L-His和NaN3后，体系中活性氧产量的变化.由图可知，NaN3(单线态氧猝灭剂)对超声体系中活性氧的猝灭效果不是很明显，说明该体系中单线态氧的产量相对较低；然而，BHT、Vc(自由基猝灭剂)和L-His(单线态氧和羟基自由基猝灭剂)对体系中活性氧展示出明显的猝灭作用.由上述结果初步推断，超声可激活PIR产生活性氧物质.并且以自由基为主，同时产生少量单线态氧.此外，由于Vc的加入并没有使体系中所有活性氧物质发生猝灭，说明还存在其它种类活性氧物质.

3 结论

本实验利用荧光光谱和紫外可见光谱研究了超声协同PIR对BSA的损伤作用及其机理，并进一步考察了超声照射时间、药物浓度对其损伤作用的影响.研究结果表明，超声协同PIR可对BSA造成明显的损伤，且损伤程度随着PIR浓度和超声照射时间的增大而增强.超声可激活PIR产生单线态氧、羟基自由基、过氧化物等一系列活性氧成分，其中自由基占大多数、少部分为单线态氧、过氧化物等，且产生活性氧的能力随时间延长而增加，与药品浓度有一定的关系.该研究对声敏剂的开发及超声协同声敏剂在抗肿瘤、抗菌治疗中创新性应用具有重要意义.