金刚纂的化学成分研究

段云凤，尹力玄，娄嘉豪，何 旎，王计宏，赖 祺，尹俊林，曾广智

(云南民族大学 民族医药学院 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

大戟属(EuphorbiaL.)是大戟科(Euphorbieceae)植物中最大的一个属，全世界有 2 000 余种，我国有80多种.大戟属植物是重要的药用植物，二萜酯类成分是大戟属植物的主要活性成分，多数具有抗肿瘤、抗病毒、皮肤刺激以抗癌活性[1].

金刚纂(EuphorbianeriifoliaL.)，大戟科大戟属植物，有小毒，是我国传统的傣药之一.其化学成分主要是二萜、三萜及黄酮类化合物，其中二萜类成分含量丰富，结构类型多样[2].金刚纂叶或茎具有清火解毒，消肿止痛，泻下通便和杀虫功效[3].目前，金刚纂化学成分的研究结果表明，该植物的主要成分为二萜类化合物，并以阿替生烷型二萜为主；三萜类成分的含量也较多，但是结构变化不大；另外，该植物中还含有香豆素类化合物[4].金刚纂的药理活性研究表明：金刚纂粗提物有乙酸乙酯相显示出抑制 LPS 诱导的RAW264.7细胞NO生成，提示具有较好的抗炎活性[5]；金刚纂中分离得到的三萜化合物可抵抗HIV诱导的细胞病变作用[6]；金刚纂中分离得到的二萜化合物针对一组人类癌细胞系，以紫杉醇为阳性对照做了药理活性研究，显示出具有抗癌活性[7].

为了细分金刚纂化合物成分研究，本文利用多种分离手段，对金刚纂甲醇提取物展开系统研究，得到12个化合物(见图1)，丰富了其化合物的种类.并对单个化合物进行了抗氧化活性研究，化合物10在 100 μmol/L 时具有一定的自由基清除能力.

图1 化合物1 ～ 12的化学结构

1 实验部分

1.1 材料与仪器

6420-TripleQuadLC/MS(Agilent Technologies，中国)；DRX-600型核磁共振仪(Bruker，瑞士)；NP7000泵-NU3000制备液相(江苏汉邦，中国)；BS124S型电子分析天平(Sartorius，德国)；EYELA N-1300自动旋转蒸发仪(上海圣科，中国).

柱色谱用硅胶(100 ～ 400目；青岛海洋，中国)；Sephadex LH-20(GE Healthcare，美国)；薄层色谱硅胶板GF254(青岛海洋，中国)；色谱级甲醇(霍尼韦尔，美国)，纯净水(娃哈哈，中国)；其它化学试剂均为分析纯(上海科技，中国)；显色剂：5%硫酸-乙醇溶液(105 ℃ 加热显色)、10%磷钼酸-乙醇溶液和茴香醛显色剂.

1.2 植物材料

金刚纂样品于2019年03月购于四川省凉山州木里县白碉乡，药材经昆明采智技术有限公司鉴定为金刚纂(EuphorbianeriifpliaL.)全株.标本保存于云南民族大学民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室.

1.3 提取与分离

金刚纂(27 kg)用95%甲醇提取3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏 2.5 kg.将浸膏悬浮于适量水中，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次分别萃取3次，合并浓缩得石油醚部分浸膏 140.62 g，乙酸乙酯部分浸膏 358.88 g，正丁醇部分浸膏 210.7 g.石油醚部分用60 ～100目硅胶 200 g 拌样进行柱色谱分离，洗脱梯度系统为石油醚∶二氯甲烷(体积比，25∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1)，经TLC检测合并相同组分，共得到8个组分，分别记为Fr.A～Fr.H.Fr.C(16.34 g)用MCI(甲醇∶水,体积分数50%～100%)分离，得到4个组分Fr.C-1 ～ Fr.C-4，Fr.C-3(3.15 g)经反相中压制备液相色谱、正相硅胶柱色谱柱分离，然后用Sephadex LH-20(甲醇)纯化，得到化合物1(126 mg)和化合物2(39.2 mg).Fr.D(13.15 g)经硅胶柱色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯(体积比，30∶1～5∶1)梯度洗脱，得到5个组分Fr.D-1～Fr.D-5.组分Fr.D-2(1.502 g)经反复硅胶柱层析，得到化合物3(39.2 mg)和化合物4(68.9 mg).Fr.E(8.26 g)经Sephadex LH-20(甲醇)分离，得到3个组分Fr.E-1～ Fr.E-3.组分Fr.E-2(1.24 g)经反复硅胶柱层析，得到化合物5(11.3 mg)和化合物6(21.8 mg).Fr.E-3(3.060 8 g)用MCI(甲醇∶水,体积分数70%～100%)分离，得到5个组分Fr.E-1～ Fr.E-5.Fr.E-3(906.7 mg)经硅胶柱色谱分离，石油醚∶乙酸乙酯(体积比，50∶1、5∶1)梯度洗脱，得到化合物7(31.6 mg).乙酸乙酯部分用60 ～100目硅胶 500 g 拌样进行柱色谱分离，洗脱梯度系统为石油醚∶乙酸乙酯(体积比，50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1)，经TLC检测合并相同组分，共得到6个组分，分别记为Fr.1～Fr.6.组分Fr.1(3.076 g)经反复硅胶柱层析，用Sephadex LH-20(甲醇-二氯甲烷)纯化，得到化合物8(7.9 mg)和9(6.5 mg).组分Fr.4(19.81 g)用MCI(甲醇∶水,体积分数50%～100%)分离，得到5个组分Fr.4-a～ Fr.4-e.组分Fr.4-b经反复柱层析，然后用Sephadex LH-20(甲醇)分离，得到化合物10(13.4 mg)和11(8.1 mg).Fr.5(17.809 g)经硅胶柱层析后，用MCI(甲醇∶水,体积分数60%～100%)分离，得到6个组分Fr.5-1～ Fr.E-6.组分Fr.5-4用HPLC(甲醇∶水，体积比75∶25；流速 1.0 mL/min)纯化，分离得到化合物12(13.2 mg，tR=33.4 min).

1.4 化合物的抗氧活性研究

采用自由基清除反应(DPPH )实验评价化合物的抗氧化活性.将化合物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中备用，将稀释好的样品加入96孔板中，每孔 5 μL，之后加入用甲醇稀释的 0.025 g/L 的DPPH 溶液，每孔 195 μL，混匀后室温反应 20 min 后用微孔板检测器后于 515 nm 波长下检测吸收值.同时设置DMSO组为阴性对照，根据以下公式计算化合物清除自由基DPPH·的百分有效率

其中NC为溶剂对照组；Sample为测试样品组.

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色结晶，分子式为C10H8O4，分子量=192.04.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=3.83(3H，s，-OCH3)，6.21(1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，6.78(1H，s，H-8)，7.22(1H，s，H-5)，7.90(1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，10.26(1H，s，OH).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=56.4(-OCH3)，103.2(C-8)，109.9(C-5)，110.9(C-10)，112.1(C-3)，144.9(C-4)，145.6(C-6)，149.9 (C-9)，151.5(C-7)，161.1(C-2).经与文献[8]对照，确定为东莨菪内酯.

化合物2淡黄色油状物，分子式为C6H6O3，分子量=126.03.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=4.51(2H，s，-CH2)，5.56(1H，s，-OH)，6.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-4)，7.45(1H，d，J=3.6 Hz，H-3)，9.53(1H，s，-CHO).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=57.6(C-8)，110.0(C-4)，122.8(C-3)，152.3(C-2)，160.7(C-5)，177.7(C-1).经与文献[9]对照，确定为5-羟甲基-2-呋喃甲醛.

化合物3白色结晶，分子式为C30H50O，分子量=426.38.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.83(3H，s，H-25)，0.96(3H，s，H-29)，0.99(3H，s，H-30)，1.03(3H，s，H-27)，1.06(3H，s，H-24)，1.09(3H，s，H-26)，1.13(3H，s，H-23)，1.16(3H，s，H-28)，3.46(1H，br.s，H-3)，5.62(1H，d，J=8.78 Hz，H-6).13C NMR(100 MHz，CDCl3):δ=16.2(C-25)，18.2(C-1)，18.4(C-26)，19.6(C-27)，23.6(C-7)，25.4(C-24)，27.8(C-2)，28.2(C-20)，28.9(C-23)，30(C-17)，30.3(C-12)，32.0(C-28，C-15)，32.4(C-30)，33.1(C-19)，34.5(C-29)，34.6(C-11)，34.8(C-9)，35.0(C-21)，36(C-22)，37.8(C-13)，38.9(C-16)，39.3(C-14)，40.8(C-4)，43(C-18)，47.4(C-8)，49.7(C-10)，76.3(C-3)，122.0(C-6)，141.6(C-5).经与文献[10]对照，确定为5(6)-gluten-3α-ol.

化合物4白色粉末，分子式为C32H52O2，分子量=468.39.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.83(3H，s，H-24)，0.85(3H，s，H-23)，0.85(3H，s，H-28)，0.86(3H，s，H-25)，0.94(3H，s，H-27)，1.02(3H，d，J=3.6 Hz，H-29)，1.03(3H，s，H-26)，2.05(3H，s，CH3CO)，4.48(1H，dd，J=1.0，6.0 Hz，H-3α)，4.61(2H，br.s，H-30).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=14.0(C-27)，14.6(C-25)，15.4(C-26)，15.9(C-24)，16.2(C-6)，18.3(C-29)，19.5(-OAc)，21.5(C-11)，25.5(C-2)，25.6(C-21)，26.2(C-12)，26.6(C-28)，27.4(C-15)，28(C-23)，34.1 (C-7)，34.5(C-17)，37.1(C-10)，38.3(C-4)，38.7(C-19)，38.8(C-1)，38.9(C-13)，39.2(C-16)，39.4(C-22)，40.9(C-8)，42(C-18)，48.7(C-18)，50.5(C-9)，55.4(C-5)，79.0(C-3)，107.1(C-30)，154.6(C-20)，170.9(-OAc).经与文献[11]对照，确定为蒲公英甾醇乙酸乙酯.

化合物5白色结晶，分子式为C30H50O，分子量=426.38.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.77(3H，s，H-24)，0.79(3H，s，H-28)，0.84(3H，s，H-25)，0.97(3H，s，H-27)，0.98(3H，s，H-23)，1.04(3H，s，H-26)，1.69(3H，s，H-30)，3.18(1H，dd，J=10.8，4.7 Hz，H-3)，4.56(1H，s，H-29b)，4.69(1H，s，H-29a).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=14.5(C-27)，15.8(C-26)，16.0(C-25)，18.0(C-28)，19.8(C-3)，20.0(C-6)，21.0(C-24)，21.6(C-11)，25.2(C-12)，26.7(C-21)，27.5(C-15)，29.9(C-21)，33.6(C-7)，34.2(C-1)，35.6(C-16)，36.9(C-10)，38.2(C-13)，39.7(C-2)，40.0(C-22)，40.8(C-8)，43.0(C-17)， 43.0(C-14)，47.5(C-4)，48.0(C-19)，48.4(C-18)，49.8(C-9)，55.0(C-5)，109.4(C-29)，151.0(C-20)，218.32(C-30).经与文献[12]对照，确定为羽扇豆醇.

化合物6白色粉末，分子式为C30H50O，分子量=426.38.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.73(3H，s，Me-24)，0.87(3H，s，Me-25)，0.88(3H，d，J=7.0 Hz，Me-23)，0.95(3H，s，Me-29)，1.00(3H，s，Me-30)，1.01(3H，s，Me-26)，1.05(3H，s，Me-27)，1.18(3H，s，Me-28).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=6.8(C-23)，14.7(C-24)，18.3(C-25)，18.7(C-7)，19.4(C-27)，20.3(C-26)，22.5(C-1)，28.3(C-20)，30.1(C-17)，30.6(C-12)，31.8(C-30)，32.2(C-28)，32.5(C-15)，32.9(C-21)，35.1(C-29)，35.4(C-19)，35.4(C-11)，35.7(C-16)，36.1(C-9)，37.6(C-13)，38.4(C-22)，39.8(C-14)，40.1(C-6)，41.4(C-2)，41.6(C-5)，42.4(C-18)，53.2(C-8)，58.4(C-4)，59.5(C-10)，214.0(C-3).经与文献[13]对照，确定为无羁萜.

化合物7白色结晶，分子式为C29H50O，分子量=414.36.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0. 69(3H，s，CH3-18)，0.79(3H，d，J=5.5 Hz，CH3-27)，0.81(3H，t，J=7.4 Hz，CH3-29)，0. 83(3H，s，CH3-19)，0. 84(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-26)，0. 91(3H，d，J=6. 0 Hz，H-21)，3. 55(1H，m，H-3)，5.01(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-23)，5. 13(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-22)，5. 36(1H，br.d，J=5. 0 Hz，H-6).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=11.9(C-18)，12.0(C-29)，18.8(C-21)，19.0(C-27)，19.1(C-19)，19.4(C-26)，19.8(C-11)，21.1(C-28)，23.1(C-15)，24.3(C-23)，26.1(C-16)，28.3(C-25)，29.1(C-2)，31.6(C-7)，31.9(C-8)，33.9(C-22)，36.2(C-20)，36.5(C-10)，37.3(C-1)，39.8(C-12)，42.2(C-13)，42.3(C-4)，45.8(C-24)，50.1(C-9)，56.1(C-17)，56.8(C-14)，71.7(C-3)，121.7(C-6)，140.8(C-5).经与文献[14]对照，确定为豆甾醇.

化合物8白色粉末，分子式为C31H52O，分子量=440.40.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.33，0.55(各1H，d，J=4.0 Hz，H-19)，0.81(3H，s，CH3-30)，0.89(3H，s，CH3-28)，0.90(2H，d，J= 6.4Hz，CH3-21)，0.97(6H，s，CH3-18，29)，1.02(3H，d，J=6.8 Hz，CH3-27)，1.03(3H，d，J=6.8 Hz，CH3-26)，3.29(1H，m，H-3).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=14.0(C-30)，18.0(C-18)，18.2(C-21)，19.3(C-28)，20C-9)，21.1(C-6)，21.8(C-26)，22.0(C-27)，25.4(C-29)，26.0(C-10，C-11)，26.4(C-16)，28.1(C-7)，29.9(C-19)，30.3(C-2)，31.3(C-23)，31.9(C-1)，32.9(C-15)，33.8(C-25)，35.0(C-22)，35.6(C-12)，36.1(C-20)，40.4(C-4)，45.2(C-13)，47.1(C-5)，47.9(C-8)，48.8(C-14)，52.2(C-17)，78.8(C-3)，105.9(C-31)，156.8(C-24).以上数据与文献[15]对照一致，鉴定为环阿屯醇.

化合物9淡黄色粉末，分子式为C16H18O9，分子量=354.09.1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ=2.06(2H，ddd，J=14.1，9.0，6.7 Hz，H-6)，2.21(2H，ddd，J=17.0，13.6，2.5 Hz，H-2)，3.73(1H，dd，J=8.4，3.0 Hz，H-4)，4.16(1H，m，H-3)，5.33(1H，td，J=9.0，4.4 Hz，H-5)，6.26(1H，d，J=16.2 Hz，H-8′)，6.78(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.95(1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6′)，7.05(1H，d，J=1.8 Hz，H-2′)，7.56(1H，d，J=16.2 Hz，H-7′).13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ=36.2(C-2)，37.1(C-6)，68.0(C-5)，70.3(C-4)，70.8(C-3)，73.4(C-1)，114.3(C-8′)，114.7(C-2′)，115.7(C-5′)，121.3(C-6′)，125.6(C-1′)，144.9(C-7′)，145.5(C-3′)，148.3(C-4′)，165.7(C-9′)，174.9(C-7).经与文献[16]对照，确定为绿原酸.

化合物10淡黄色固体，分子式为C27H30O16，分子量=610.15.1H NMR(400 MHz，CD3OD)：δ=1.12(3H，d，J=6.0 Hz，H-6‴，Rha-CH3)，3.55～3.24(8H，m，Glu-H-2″～5″，Rha-H-2‴～5‴)，3.63(1H，m，H-6″b)，3.81(1H，dd，J=11.0，1.2 Hz，H-6″a)，4.51(1H，d，J=1.6 Hz，Rha-H-1‴)，5.10(1H，d，J=7.6 Hz，Glu-H-1″)，6.19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.38(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，7.61(1H，dd，J=8.4，2.0 Hz，H-6′)，7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′).13C NMR(100 MHz，CD3OD)：δ=94.9(C-8)，100.0(C-6)，105.6(C-10)，116.1(C′-2)，117.8(C′-5)，123.1(C′-1)，123.6(C′-6)，135.6(C-3)，145.8(C′-3)，149.8(C′-4)，158.5(C-2)，159.4(C-9)，162.9(C-5)，166.0(C-7)，179.4(C-4)，Glu: 68.5(C″-6)，72.1(C″-4)，75.7(C″-2)，77.2(C″-5)，78.10(C″-3)，104.7(C″-1)，Rham: 17. 9(C‴-6)，69.7(C‴-5)，71.4(C‴-3)，72.3(C‴-2)，73.9(C‴-4)，102.4(C‴-1).经与文献[17]对照，确定为芦丁.

化合物11白色粉末，分子式为C20H32O2，分子量=304.24.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.82(3H，s，H-20)，0.86(3H，s，H-19)，0.89(3H，s，H-18)，0.95(3H，d，J=6.9 Hz，H-16)，0.99(3H，d，J=6.9 Hz，H-17)，1.71(2H，ddd，J=14.9，12.8，2.2 Hz，H-6α)，1.78(2H，ddd，J=14.3，12.1，5.0 Hz，H-12α)，1.99(1H，dt，J=14.3，3.4 Hz，H-12β)，2.10(2H，ddd，J=14.9，3.9，1.5Hz，H-6β)，2.32(2H，br.s，H-14)，3.24(1H，t，J=2.0 Hz，H-7).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=15.7(C-11)，17.6(C-17)，17.8(C-16)，18.0(C-2)，19.9(C-20)，22.4(C-18)，22.9(C-6)，23.1(C-12)，32.5(C-4)，32.7(C-19)，33.1(C-15)，34.2(C-10)，39.3(C-1)，42.8(C-3)，44.3(C-5)，49.1(C-9)，53.9(C-7)，55.6(C-8)，62.5(C-14)，63.2(C-13).经与文献[17]对照，确定为roscotane D.

化合物12白色固体，分子式为C30H48O，分子量=424.37.1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ=0.80(3H，s，H-28)，0.94(3H，s，H-25)，0.96(3H，s，H-27)，1.04(3H，s，H-24)，1.08(6H，s，H-23，26)，1.68(3H，s，H-30)，4.57(1H，br.s，H-29a)，4.69(1H，br.s，H-29b).13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ=13.5(C-27)，14.7(C-26)，14.9(C-25)，17(C-28)，18.7(C-30)，19.2(C-6)，20(C-24)，20.4(C-11)，24.2(C-12)，25.7(C-23)，26.4(C-15)，28.8(C-21)，32.6(C-7)，33.1(C-1)，34.5(C-16)，37.7(C-13)，38.6(C-2)，38.9(C-22)，39.7(C-8)，41.8(C-17)，41.9(C-14)，46.3(C-4)，46.9(C-19)，47.3(C-18)，48.8(C-9)，53.9(C-5)，108.4(C-29)，149.9(C-20)，218.32(C-3).经与文献[12]对照，确定为羽扇烯酮.

2.2 化合物的抗氧活性研究

通过DPPH自由基清除反应对化合物1～12的抗氧化能力进行了测试，结果显示化合物10在 100 μmol/L 时具有一定的自由基清除能力，其对DPPH自由基清除的百分抑制率39.56%.

3 结语

本研究从金刚纂中分离得到12个化合物，分别为东莨菪内酯(1)、5-羟甲基-2-呋喃甲醛(2)、5(6)-gluten-3α-ol(3)、蒲公英甾醇(4)、羽扇豆醇(5)、无羁萜(6)、豆甾醇(7)、环阿屯醇(8)、绿原酸(9)、芦丁(10)、roscotane D(11)和羽扇烯酮(12).通过DPPH自由基清除反应对化合物1～12的抗氧化能力进行了测试，结果显示化合物10在 100 μmol/L 时具有一定的自由基清除能力，其对DPPH自由基清除的百分抑制率39.56%.本研究通过对金刚纂化学成分及抗氧化活性研究，进一步丰富了金刚纂的化学成分，也为金刚纂作为民族药提供实验依据和理论基础.