基于分子对接技术探究黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的机制

席晓萌，姜云鸽，王 琳，黄相中，田 凯

(1.云南民族大学 理论与计算化学实验室，云南 昆明 650500；2.云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

糖尿病是一种全球性的常见的慢性疾病，是由遗传、肥胖、免疫功能紊乱及感染等因素造成的，该病会使患者的胰岛功能减退甚至丧失生物功能，从而导致糖、蛋白质、电解质代谢紊乱，进而引发高血糖症[1-2].患者如果长期不能控制自己的血糖达到正常水平，就会引发全身性的糖尿病并发症，诸如糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变、动脉粥样硬化等[3-4].现阶段，糖尿病已成为危害人类健康的重要疾病之一，防治糖尿病及其并发症是一项关乎全人类健康的艰巨工程.糖尿病患者一经发病，往往很难治愈，只能终生服用各类降糖类药物或者注射胰岛素.

在上世纪八十年代，临床研究发现了α-葡萄糖苷酶抑制剂，并且将其研制成为了一种新型口服降糖类药物，该药在治疗过程中特别是对餐后血糖的控制上有着较大的优势：食物当中含有大量的碳水化合物，经过口腔唾液和胰淀粉酶的消化作用后会变成含有少量葡萄糖分子的低聚糖，而α-葡萄糖苷酶则会在这些低聚糖的非还原末端产生作用，进而释放葡萄糖，通过小肠粘膜细胞吸收后进入到血液循环当中，导致血糖升高[5].而α-葡萄糖苷酶抑制剂可以降低机体对葡萄糖的吸收，同时也能抑制机体内碳水化合物的代谢，并将原有的葡萄糖分子进行分解，成为小分子葡萄糖.所以，这类抑制剂能够实现对机体血糖良好的控制，尤其是在调控2型糖尿病时更加有效，特别适合中老年糖尿病患者的使用.这类药物主要包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等[6-7].

黄酮类化合物泛指通过一个三碳原子实现2个酚羟基的苯环(A环，B环)的联结，由此所形成的若干种化合物，其基本母核为2-苯基色原酮.黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团.此外，它还常与糖结合成苷[8].黄酮类化合物广泛存在于天然的植物和中草药中，正是依赖于这些中草药，使黄酮类化合物的获取变得相对容易，给研究开展提供了便利.表1展示的是一些黄酮类化合物的结构式：

表1 常见的黄酮类化合物结构式

研究表明，黄酮类化合物的生理活性与药理活性都相对较多，在抗炎症、抗氧化、抗糖尿病并发症以及抗癌症等方面都能够产生一定的疗效[9-11].黄酮类化合物拥有毒性低的特点，在一些食物或者化妆品中都有添加.近几年来，有学者发现葛根异黄酮类化合物具有降血糖、降血脂及扩张冠状血管的作用[12]；梅桂雪等[13]研究发现，黄酮类化合物可以通过抑制 Maillard 反应、增强机体对葡萄糖的摄取、抑制醛糖还原酶、促进胰岛素的分泌、作用于血管紧张素、抑制α-葡萄糖苷酶等，发挥防治糖尿病的作用；银杏黄酮能使患有2型糖尿病的病人血小板中丙二醛的水平显著降低，以此实现对β细胞更为有效的保护，同时还能够使细胞内游离钙离子的浓度相应提升，通过其对蛋白激酶Ⅱ的依赖性，实现对胰岛素分泌的调控[14].现阶段，新型的、高效的、低毒的抗糖尿病药物是药物研发的主流，依据黄酮类化合物的多种优势，可以将其作为研制新型α-葡萄糖苷酶抑制剂类抗糖尿病药物的活性组分.

分子对接(molecular docking)是指从药物小分子以及蛋白大分子各自的三维结构入手，检验两者能不能结合，同时预测结合模式和亲合力的一种理论模拟方法.寻找药物分子与受体蛋白之间合理的结合模式，是分子对接的根本[15].当前，计算机辅助药物设计(computer aided drug design，CADD)成为药物研发中比较靠谱的新方法，而分子对接技术作为CADD的重要方法之一，由于相对廉价及效果突出，成为了寻找和检索先导化合物的重要手段[16].α-葡萄糖苷酶是糖苷水解酶大家族中的一大类酶，主要功能为水解葡萄糖苷键，释放出葡萄糖作为产物，是生物体糖代谢途径中不可或缺的一类酶.α-葡萄糖苷酶来源广泛，几乎存在于所有以碳水化合物为能源的且具有细胞结构的生物体内，因此可以作为分子对接中的受体蛋白使用.常用的分子对接软件有Dock、AutoDock和Discovery Studio等，本文将使用Discovery Studio 2.5软件中的半柔性对接(Libdock)模块来进行分子对接分析[17-18]，用以揭示受体蛋白(α-葡萄糖苷酶)和药物(黄酮类化合物)之间的相互作用关系，为研制新型α-葡萄糖苷酶抑制剂类抗糖尿病药物提供理论计算基础.

1 计算详情

1.1 配体小分子的准备

本文所使用的44个黄酮类化合物均由云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室提供.将上述小分子分别用DS软件画出，保存为sdf格式文件，并放在同一文件夹下.为了实现批量的在DS软件中进行分子对接分析，将上述文件夹中的44个sdf文件整合成一个复合的文件，DS软件可以一次性地对所有配体小分子的结构进行读取.

1.2 受体蛋白的准备

通过RCSB PDB(http://www1.rcsb.org/)数据库按照关键词“α-glucosidase”进行搜索，获取相应的PDB格式的蛋白.本文使用的是PDB编号为3TOP的蛋白作为受体蛋白进行分子对接研究.

1) 将下载好的蛋白通过DS 2.5软件打开，进行去水、加氢、补充非完整氨基酸残基等操作；

2) 将蛋白显示方式更改为丝带状显示，以方便后续观察；

3) 将蛋白定义为受体分子，并选择自动查找可能的有效结合位点，这样有助于获取活性较高的位点；

4) 给结合位点定义球型区域，每个位点要单独定义，区域在完全包裹位点的前提下尽可能小，以此来提高对接效率和精度.

1.3 分子对接仿真运行

将处理后的受体蛋白通过DS软件中Protocols面板中Dock Ligand (Libdcok)方法与小分子复合文件进行分子对接分析.部分对接示意图如图1所示.

图1 44个黄酮类小分子与3TOP蛋白8号位点分子对接示意图

2 结果与分析

自动获取的活性位点是按照活性大小从高往低排列的，该计算中受体蛋白一共获取了33个位点，选取其中前8个位点进行分析，以LibDock Score打分为标准，分数排在第1位的就是软件认为最好的结合方式.文中选取了8个位点对接结果中排名前10的对接结果进行分析，前10个对接结果如表2所示.

由表2可以看出，HT15配体与受体蛋白3TOP对接分数最高，说明HT15分子与蛋白结合程度最为紧密；之后的HT18、HT7一直到HT21配体对接分数都达到了130以上，说明这些配体与受体蛋白也具有强的相互作用.推测以上配体可能是抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分.为了方便观察与分析配体与受体之间的相互作用，将上述对接排名前四的结果生成三维图和二维图.

表2 对接结果分数表(排名前10)

续表2

图2和图3展示的是HT15分子与3TOP蛋白对接结果三维和二维图，由上图可知，配体和受体之间存在强的相互作用，主要作用类型包括氢键、π键、π-π共轭效应和疏水作用等，例如：HT15与蛋白3TOP的残基ASN 1583、CYS 1249、GLU 1258、SER1261、HIS 1584形成了5个氢键，具有很强的氢键作用；TRY1253与配体的芳香环形成了稳定的π-π疏水堆积作用；ARG 1250和LEU1262的阳离子与苯环的π电子之间存在p-π共轭效应；ASP1593与ARG1591也有相似的作用，其阴离子与配体的苯环形成了共轭效应；此外，HT15与一些疏水氨基酸如ASN1585、GLN1592、LEU1248、ILE1259、GLU1265存在很强的疏水作用，推测ARG1591在HT15与3TOP相互作用中起到了关键作用.以上结果说明HT15分子与3TOP受体蛋白之间存在强的抑制作用.

图2 HT15分子与3TOP蛋白8号位点对接三维图

图3 HT15分子与3TOP蛋白8号位点对接二维图

图4和图5展示的是HT18分子与3TOP蛋白对接结果的三维和二维图，由上图可知，配体和受体之间存在强的相互作用，主要作用类型包括氢键、π-π共轭效应和疏水作用等.例如：HT18与3TOP蛋白残基ARG1504、ILE 1758形成了2个氢键，附近也存在一些较弱的碳氢键，如ASP1759；HIS1627与配体的芳香环形成稳定的π-π疏水堆积作用，VAL1237和MET1238的阳离子与苯环的π电子之间存在p-π共轭效应；此外，HT18与一些疏水氨基酸如HIS1624、TYR1761、PHE1751、ASP1753、THR1760、SER1757、TYR1494、GLN1498、TRP1519、ARG1518、THR1628存在很强的疏水作用.以上结果说明HT18分子与3TOP受体蛋白之间存在强的抑制作用.

图4 HT18分子与3TOP蛋白6号位点对接三维图

图6和图7展示的是HT7分子与3TOP蛋白对接结果的三维和二维图，由上图可知，配体和受体之间存在强的相互作用，主要作用类型包括氢键、π键和疏水作用等.例如：HT7与3TOP蛋白残基SER1261、CYS 1249、ASN1583形成了3个氢键，具有很强的氢键作用；LEU1262、ARG1250和ARG1591的阳离子与苯环的π电子之间存在p-π共轭效应；ASP1593与ARG1591也有相似的作用，其阴离子与配体的苯环形成了共轭效应；此外,HT7与一些疏水氨基酸如GLU1258、GLU1265、TYR1253、GLN1592、ASN1585、HIS1584、LEU1248存在很强的疏水作用，推测ARG1591在HT7与3TOP相互作用中起到了关键作用.以上结果说明HT7分子与3TOP受体蛋白之间存在强的抑制作用.

图6 HT7分子与3TOP蛋白8号位点对接三维图

图7 HT7分子与3TOP蛋白8号位点对接二维图

图8和图9展示的是HT17分子与3TOP蛋白对接结果的三维和二维图，由上图可知，配体和受体之间存在强的相互作用，主要作用类型包括氢键、π键和疏水作用等.例如：HT17与3TOP蛋白残基ARG 1410、ARG1333、GLU1397形成了4个氢键，具有很强的氢键作用，值得注意的是，GLU1397不仅提供氢键的受体，本身形成氢键也提供了质子，附近也存在一些较弱的碳氢键，如GLU 1400、PHE 1289；LEU1412、LEU1401和PRO1405的阳离子与苯环的π电子之间存在p-π共轭效应；GLU1400与ARG1410也有相似的作用，其阴离子与配体的苯环形成了共轭效应；PRO1329与配体形成了稳定的p-π疏水堆积作用；此外，HT17与一些疏水氨基酸如PRO1299、SER1411、GLN1406、ASN1404、ALA1330、TYR1282、THR1290、LEU1291存在很强的疏水作用，推测ARG1410和GLU1397在HT17与3TOP相互作用中起到了关键作用.以上结果说明HT17分子与3TOP受体蛋白之间存在强的抑制作用.

图8 HT17分子与3TOP蛋白3号位点对接三维图

图9 HT17分子与3TOP蛋白3号位点对接二维图

3 结语

一个新药的问世，是一个十分漫长的过程.在药物的筛选过程中，如果每一个新化合物都进行药理实验研究，那将浪费很多人力、物力、财力，且根本无法跟上新化合物发现的节奏.计算机辅助药物设计开拓了新的药物研究领域和方法，从分子水平研究药物与受体相互作用.利用计算机虚拟药物筛选技术筛选化合物作用靶点，为后续实验研究提供强有力的理论支撑，使得实验研究具有较强的导向性.

文中主要采用分子对接的方法，研究了实验室获得的几十种黄酮类化合物与α-葡萄糖苷酶的结合模式和作用机制，明确了可能的结合位点，旨在从分子水平上阐明药物分子与蛋白质相互作用的关系.本文基于受体蛋白分子3TOP的晶体结构，通过一系列模拟计算，推测出ARG1591、ARG1410和GLU1397可能为受体的活性位点残基；得到了排名前十的对接结果，进一步筛选出9个可以起到较强抑制作用的黄酮类化合物：HT15、HT18、HT7、HT17、HT23、HT2、HT16、HT43、HT21，它们是通过不同的位点发挥药效；选择上述前4结果生成相互作用模式图并加以分析，证实了上述黄酮类化合物作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的可行性，说明了本研究应用上述介绍的分子优化对接方法来进行相关计算是可靠的，能够为新型α-葡萄糖苷酶抑制剂药物的研究提供一定的理论计算依据.