植物微核技术监测土壤农药污染研究

李文义，方睿霞，尹鹏宇，杨 志，高云涛，熊华斌，李晓芬，刘满红

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500；2.云南民族大学 云南省跨境民族地区生物质资源清洁利用国际联合研究中心，云南 昆明 650500)

土壤环境质量与农产品质量、人类健康及经济社会的可持续发展息息相关，是生态文明建设的重要内容[1-3].土壤是农药在环境中的“储存地”，使用在农田中的农药绝大部分残留在土壤环境介质中，导致相关污染物在土壤环境中的逐步富集.农药残留的增加不仅使病虫害的抗性增强，迫使农药的使用量愈来愈大，环境的污染也愈来愈严重，且使农作物和食品中的残留量剧增，对人类的健康造成威胁[4].

微核(micronucleus，MCN)是指大小小于主核1/3的圆形或椭圆形的核小体，其位于细胞质中独立于主核[5]，由于环境因子干扰使染色体发生断裂或丢失，细胞进入下一次分裂时断裂的染色体没有着丝点，游离在细胞质中，不能随有丝分裂进入子细胞，从而形成大小不等的小核[6].可通过观察并统计微核的数量，计算其微核率以此评估环境污染导致染色体畸变的程度，间接地体现环境污染的程度.该技术测定的是细胞染色体受损伤的程度，更接近于污染物对生物和人类的危害情况.以植物微核技术监测环境污染, 具有操作简单、快速、灵敏、经济等特点，实验结果可靠性强，具有较强的实用性[7-8].微核的应用近年来已有部分研究[9-13]，但目前微核技术技术尚未普及和发挥其应有的作用，特别是监测土壤污染的技术本身也待完善.

近年来，随着土壤污染的加剧，国家对土壤环境保护、土壤环境监测逐步加强[14].土壤污染通常具有复合污染的特点,但现行标准中监测污染物的数量不足，尤其有机污染物数量过少[15]，土壤环境质量监测的评价及分析方法等技术体系尚不健全[16-17].利用微核土壤环境监测的相关研究较少，且未对土壤中农药监测形成较好的相关性分析及评价系统，本文拟利用植物微核技术监测分析农药土壤污染，并将微核监测结果进行分析，以期为土壤污染监测和评价提供参考.

1 实验部分

1.1 实验仪器

可自动拍照光学显微镜、分析天平、恒温培养室.

1.2 实验材料

蚕豆(昆明呈贡农资市场)、15 cm培养皿、70%啶虫脒(Acetamiprid)、甲醇、冰醋酸、浓HCl(均为分析纯)、盐酸(6 mol/L)、卡诺氏固定液、醋酸洋红染色液、姬姆萨染液、改良苯酚品红染液、卡诺氏固定液(甲醇和冰醋酸体积比为3∶1).

1.3 实验过程

1.3.1 蚕豆浸种催芽

选择大小均匀、无质变的饱满蚕豆，洗净后用纯水常规浸种、催芽 36 h，使蚕豆充分吸水膨胀，每间隔 12 h 换一次水.之后将蚕豆置于 16 ℃(蚕豆发芽的最适温度)的恒温培养室中培养 24 h，再继续用蒸馏水培养使其长出 1.0 cm 左右的初生根.

1.3.2 染毒液配制

根据啶虫脒(Acetamiprid)的使用方法(在50～100 mg/L 的浓度下，可有效地防治棉蚜，菜蚜、桃小食心虫等，以 500 mg/L 浓度施药可防治光潜蛾、桔潜蛾以及梨小食心虫等，并可杀卵)，实验使用 200 mL 溶剂，称取啶虫脒不同质量并配制成5个不同质量浓度的染毒液，即：0、35.71、71.43、285.71、714.29 mg/L，亦即：0、35.71、71.43、285.71、714.29 mg/300 g土,其中 0 mg/L 是使用蒸馏水作为阴性对照(CK).

1.3.3 土壤染毒

将各浓度的染毒液，定量、均匀地喷洒到经 2 mm 过筛处理后的 300 g 土壤中，将湿团与细土揉匀，置于 15 cm 培养皿中，平衡处理 12 h 以上待用.

1.3.4 蚕豆染毒及修复培养

分别选取胚芽发育良好(根尖长短、粗细一致)的蚕豆栽种于培养皿中，染毒18、24、48和 72 h 后，然后用蒸馏水冲洗干净，并用蒸馏水浸洗3次，每次 3 min，在室温下用蒸馏水进行修复培养12～24 h.

1.3.5 制片及镜检

1) 取材及固定 用剪刀剪下染毒后的蚕豆 1 cm 根尖，再用蒸馏水洗净根尖，用新配卡诺氏固定液固定2～24 h，使细胞的分裂处于停滞状态.

2) 解离 用蒸馏水浸洗固定好的根尖2 次，然后根尖用 6 mol/L 的盐酸解离15～30 min.

3) 制片 将解离后的蚕豆根尖用蒸馏水浸没幼根3 次，每次 2 min，切取1～2 mm 蚕豆根尖置于载玻片上，加2滴醋酸洋红染色液，染色 15 min，盖上盖玻片，覆一层吸水纸，常规压片.

通过预实验可得，当蚕豆染毒时间达到 72 h 时，蚕豆根尖出现萎蔫的情况.考虑此情况，染毒18、24和 48 h 时选取根尖和靠近根尖的部位制片观察，而染毒 72 h 时均选取靠近根尖的部位制片观察.

4) 镜检 首先在低倍镜下找到分生组织细胞分散均匀，分裂相对较多的部位，再转至高倍镜观察.

图1 蚕豆根尖细胞微核

每个根尖计数 1 000 个细胞中的微核数并进行记录，测定其微核千分率MCN‰.

2 结果与分析

2.1 不同染毒时间蚕豆根尖长势情况

在 23 ℃ 时,蚕豆细胞周期为 18 h.将蚕豆染毒18、24、48和 72 h，由表1可知，18～48 h 蚕豆根尖长势良好，蚕豆染毒达到 72 h 时，蚕豆根尖出现萎蔫的情况.染毒作用对蚕豆根尖影响较影响.

表1 4个染毒时间蚕豆根尖长势情况

2.2 不同染毒时间采用不同部位制片的微核率

通过在同一浓度和时间培养蚕豆根尖采用根尖与靠近根尖部位制片，MCN‰产生基本相同.蚕豆经啶虫脒同一浓度土壤染毒18、24和 48 h 后，MCN‰随染毒时间的增长而增大.在同一染毒时间下经不同浓度的土壤染毒，MCN‰随浓度的升高而增大，且MCN‰均有明显的升高.

当染毒时间达到 72 h 时，蚕豆根尖出现萎蔫现象，故使用靠近根尖部位制片观察.由表2可知，蚕豆通过染毒 72 h 后微核率随着啶虫脒在土壤中的浓度增大而逐渐增大.

表2 蚕豆染毒18、24、48、72 h微核率

图2 啶虫脒不同浓度、不同染毒时间对蚕豆根尖的诱变效应

综上所述，蚕豆微核率随染毒时间的增长而增大.在同一染毒时间下经不同浓度的土壤染毒，MCN‰随浓度的升高而增大.染毒时间18～48 h 的蚕豆，使用根尖和靠近根尖部位制片观察所得到的微核率差别不大，说明经过土壤染毒诱使根尖部位和最靠近根尖部位产生微核的机率基本相同.

3 结语

蚕豆随农药土壤处理时间的增长，蚕豆微核率呈增长趋势.当蚕豆染毒时间达到 72 h 时，蚕豆根尖出现萎蔫的情况.因此，监测中蚕豆根尖染毒时间为18～72 h 为宜.蚕豆微核率随染毒时间的增长而增大.在同一染毒时间下经不同浓度的土壤染毒，MCN‰随浓度的升高而增大.因此，使用啶虫脒处理蚕豆产生的MCN‰随着染毒液浓度的增大和染毒时间的增长，MCN‰均有明显的升高，表明啶虫脒对蚕豆根尖细胞具有较强的诱变效应.经过土壤染毒诱使根尖部位和最靠近根尖部位产生微核的机率基本相同.