甲啶铂与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究

彭 娟，丁 浩，叶满萍，胡 劲，普绍平，丛艳伟，王应飞

甲啶铂与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究

彭 娟1, 2，丁 浩3，叶满萍3，胡 劲1，普绍平2 *，丛艳伟2，王应飞2

(1. 昆明理工大学 材料科学与工程学院，昆明 650093；2. 昆明贵研药业有限公司，昆明 650106；3. 中国计量大学 光学与电子科技学院，杭州 310018)

用稳态荧光光谱及时间分辨荧光技术研究水溶液中甲啶铂与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。加入甲啶铂后，BSA荧光发射峰从335 nm红移到337.5 nm，并伴随着荧光强度的猝灭，表明甲啶铂与BSA发生了相互作用；单指数拟合得到的荧光寿命结果证实，甲啶铂对BSA的猝灭为静态猝灭；荧光寿命的双指数拟合结果表明，BSA的内在荧光主要是由第212位和第134位的色氨酸残基贡献的，BSA中第212位色氨酸残基和苯丙氨酸残基可能是甲啶铂的靶向目标。

甲啶铂；牛血清白蛋白(BSA)；稳态荧光；时间分辨荧光；荧光寿命

新一代铂族金属抗癌药物甲啶铂具有高效、广谱、低毒、给药方式多样以及克服交叉耐药能力强等优点[1-3],目前已在开展II/III期临床研究[4]。甲啶铂的中文名称为顺式-二氯-氨(2-甲基吡啶)合铂(II)，化学式为-[PtCl2(NH3)(C6H7N)]，化学结构如式(1)所示。

抗癌药进入人体后，通过血浆的储存和运输到达靶部位，继而产生药理作用。血清白蛋白是血浆中含量最高的一种载体蛋白，抗癌药与蛋白质相互作用的深入研究，对阐明抗癌药的作用机制有着重要的意义[5]。牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白具有高度的同源性，而且BSA价格更低，也更易获取。

光谱法特别是荧光光谱法、时间分辨荧光技术等已成为研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段[6-7]，近年来用于抗癌药物与蛋白质相互作用的研究陆续有报道[8-13]。

本文以BSA作为血药体系中的载体蛋白，采用荧光光谱法及时间分辨荧光技术[14-15]研究在模拟人体生理pH值条件下铂类抗癌药物甲啶铂与BSA之间的相互作用。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

荧光光谱采用日本日立F-2700型的荧光分光光度计。时间分辨荧光寿命测试采用英国HORIBA公司Tempro型单光子计数荧光寿命光谱仪进行，激发光源是波长为256 nm的Nano LED脉冲光源，脉宽1 ns，自带DAS6荧光衰减曲线分析软件。pH值采用上海精密科学仪器有限公司的雷磁PHS-25型pH计。两通光和四通光的石英比色皿，光程均为10 mm。

BSA购自上海伯奥生物科技有限公司(纯度为99%)，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)，NaOH等均为分析纯试剂。实验用水为去离子水，经检测无荧光杂质。

1.2 溶液配制

1) Tris-HCl缓冲溶液：称取3.94 g Tris-HCl晶体溶解于500 mL的去离子水中，配成0.050 mol/L的溶液，用0.6 mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.4，静置备用。

2) BSA母液：称取0.040 g BSA粉末溶解于50 mL Tris-HCl缓冲溶液中，配成0.80 mg/mL的BSA母液，静置备用。

3) 甲啶铂母液：称取0.0075 g甲啶铂溶解于20 mL Tris-HCl缓冲溶液中，配成1.0 mmol/L的甲啶铂母液，静置备用。

4) 甲啶铂稀释液系列(编号a~h)：在8个10 mL试管中，分别加入不同量的甲啶铂母液，用Tris-HCl缓冲溶液稀释至刻度，最终得到8个不同浓度甲啶铂稀释液，对应浓度依次为：0.0001、0.0005、0.003、0.005、0.007、0.009、0.020和0.080 mmol/L。

5) 甲啶铂与BSA混合液系列(编号：a'~h')：在8个5 mL试管中，分别依次加入1 mL BSA母液和1 mL不同浓度甲啶铂稀释液，用Tris-HCl缓冲溶液稀释至刻度，混匀静置2 min，得到不同浓度的甲啶铂与BSA混合液。混合液中BSA的浓度0.16 mg/mL，甲啶铂浓度依次为：0.00002、0.0001、0.0006、0.001、0.0014、0.0018、0.0040和0.016 mmol/L。

1.3 光谱测定

1) 稳态荧光光谱。设定激发波长为256 nm 时，测定荧光发射波长范围为270~450 nm，设定激发波长为280 nm 时，测定荧光发射波长范围为290~450 nm。扫描速度为300 nm/min，狭缝宽度为5 nm，光电倍增管电压为400 V (测量甲啶铂时为700 V)，对1.2中相应的溶液进行测定。

2) 时间分辨荧光。以测量Tris-HCl缓冲溶液的衰减曲线作为仪器响应曲线，狭缝宽度为12 mm，最大光子数为3000，在室温下测量，激发波长为256 nm，测量波长为335 nm和281 nm，对1.2中溶液系列进行测定，用指数衰减曲线进行拟合。

2 结果与讨论

2.1 稳态荧光光谱特征

图1为甲啶铂与BSA混合液的不同测试条件下的荧光光谱图。

一般荧光光谱的测试采用最大吸收波长作为荧光的激发波长，BSA的最大吸收峰在278 nm，一般采用280 nm作为激发波长。受荧光寿命仪器激发波长实验条件的限制，选择256 nm作为激发波长。为此对不同激发波长下的荧光强度进行对比测定，图1(a)是浓度为0.16 mg/mL的BSA溶液在256 nm和280 nm激发下的荧光光谱，内插图为2个激发波长下的荧光光谱归一化处理后的结果。由图1(a)可以看出，BSA在256 nm和280 nm激发下的荧光光谱基本一致，发射峰最大处都在335 nm，表明采用256 nm激发波长是可行的。

图1(b)是在256 nm波长激发下，BSA溶液(0.16 mg/mL)、甲啶铂稀释液系列、甲啶铂与BSA混合液系列的荧光光谱。由图1(b)可以看出，在甲啶铂的荧光发射峰283 nm处。甲啶铂稀释液系列(a~h)浓度变化范围800，而荧光强度为750~1200，变化范围约450，荧光强度与甲啶铂浓度变化无规律性关系。加入甲啶铂后，BSA的荧光发生猝灭，荧光强度从大约1700降低到400左右，猝灭程度与甲啶铂浓度同样无规律性的关系。混合液系列(a'~h')中甲啶铂的浓度是甲啶铂稀释液系列(a~h)中的1/5，荧光强度波动范围约为100，也约为荧光强度变化范围的1/5。由此推测，不同浓度的甲啶铂与BSA混合液的荧光强度波动是甲啶铂自身造成的。据此推测甲啶铂对BSA的荧光猝灭为静态猝灭。根据图1(b)，在256 nm波长激发下，甲啶铂在300~400 nm处的荧光发射强度很小，因此在后续测定中，当测量波长为335 nm时，不考虑甲啶铂自身的荧光衰减情况。在甲啶铂和BSA的混合液中，当甲啶铂的浓度为0.001 mmol/L时，BSA荧光发射峰发生最大红移，从335 nm红移到337.5 nm，红移了2.5 nm，如图1(c)所示。推测甲啶铂对BSA的荧光猝灭为静态猝灭。

(a). 256 nm和280 nm激发下荧光光谱比较(Comparison of fluorescence spectra excited at 256 and 280 nm)；(b). 荧光淬灭(Fluorescence quenching); (c). 荧光发射最大红移(Maximum red shift of fluorescence emission)

图1 荧光光谱

Fig.1 The fluorescence spectra

2.2 时间分辨荧光技术测定荧光寿命

BSA分子中含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)等氨基酸残基，能发射较强的内源荧光[16-17]。甲啶铂对BSA产生了荧光猝灭，要判断甲啶铂对BSA荧光猝灭是静态猝灭还是动态猝灭，需要知道荧光猝灭随温度的变化关系[18]、吸收光谱[19]或荧光寿命[20]等相关信息。

为了进一步探讨甲啶铂对BSA的荧光猝灭机理，以测量Tris-HCl缓冲溶液的衰减曲线作为仪器响应曲线(Prompt)，测量常温下BSA溶液(0.16 mg/mL)、甲啶铂(0.005 mmol/L)-BSA(0.16 mg/mL)混合液的时间分辨荧光。激发波长为256 nm，测量波长为335 nm，由仪器自带的DAS6荧光衰减曲线分析软件完成荧光寿命计算。通过调整拟合方程、拟合范围等参数，得到拟合指数(2)接近于1的荧光寿命拟合结果，测定和计算的结果如图2所示。

由荧光衰减曲线(图2(a))可见，在335 nm测量，加入甲啶铂后的BSA溶液的荧光衰减曲线与单一BSA溶液的荧光衰减曲线几乎完全重叠。说明加入甲啶铂后，BSA的组分在常温条件下不会发生变化。通过单指数拟合(图2(b))得到荧光寿命值，BSA溶液的荧光寿命为5.47 ns，加入甲啶铂后的BSA溶液变为5.87 ns，2种荧光寿命的比率接近于1。加入甲啶铂后的BSA溶液荧光寿命的微小变化符合猝灭的静态性质[21]。因此推测，甲啶铂对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，这与稳态荧光光谱结果一致。据文献[21-22]数据，Trp荧光寿命为6 ns，与BSA的荧光寿命比较接近。由此可以判断，BSA中的荧光主要是由Trp残基产生。

图2 测量波长为335 nm的荧光衰减曲线(a)和单指数拟合曲线(b)

将甲啶铂与BSA混合液的荧光强度衰减曲线通过双指数拟合，拟合方程为：

()=B1e-t/τ1+ B2e-t/τ2(2)

这里的B1和B2分别是第个寿命的衰减幅度，1和2分别是第个拟合的寿命，为时间。经过双指数拟合后计算得到的不同浓度的甲啶铂与BSA混合液的荧光寿命参数，如表1所列。

表1 BSA(12.12 mmol/L)与甲啶铂混合液的拟合参数及荧光寿命(测定波长335 nm)

Tab.1 Fitting parameters and fluorescence life of BSA (12.12 mmol/L) mixed with picoplatin (measured at 335 nm)

由表1可知，BSA溶液有2个荧光寿命(1和τ)，说明体系中含有2种发荧光的物质。当加入甲啶铂后，1随浓度的变化在2.5 ns附近小幅度浮动，而2在6.3 ns附近小幅度浮动。BSA分子中含有2个Trp残基[23]，分别位于第212和134位，其中一个(134位)被包埋在BSA分子内部，另一个(212位)则暴露在BSA分子表面。加入甲啶铂后BSA外部的Trp残基受到影响，荧光寿命(1)会大大降低；而内部的Trp残基被BSA分子保护，基本不与猝灭剂接触，荧光寿命(τ)几乎不发生变化。这一结论与文献[23]所述BSA主要是由第212位Trp残基发出荧光的结论一致。这一结果表明甲啶铂与BSA的结合位置极有可能为第212位Trp残基。

由图1(c)可知，加入甲啶铂后的BSA溶液在281 nm左右处有一细小的发射峰，可用于测量时间分辨荧光。甲啶铂在283 nm处有最大荧光发射峰，因此测量时要考虑甲啶铂自身的荧光衰减情况。在281 nm波长测定了甲啶铂溶液(0.005 mmol/L)、BSA溶液(0.16 mg/mL)、甲啶铂(0.005 mmol/L)-BSA(0.16 mg/mL)混合液的时间分辨荧光，进行双指数拟合，拟合结果列于表2，拟合图如图3所示。

表2 BSA(12.12 mmol/L)与甲啶铂混合液的拟合参数及荧光寿命(测定波长281 nm)

Tab.2 Fitting parameters and fluorescence life of BSA (12.12 mmol/L) mixed with picoplatin (measured at 281 nm)

图3 测量波长281 nm的荧光衰减曲线(a)和双指数拟合曲线(b)

由表2可知，加入甲啶铂的BSA溶液有2个荧光寿命，分别为1≈0.26 ns，2≈4.2 ns。1小于仪器激发光源的激发脉冲(1 ns)，没有实际意义而不需讨论；仅需分析加入单一BSA的荧光寿命(2≈4.4 ns)，以及加入甲啶铂的BSA的荧光寿命(2≈4.2 ns)。根据文献[24]数据，Phe的最大荧光发射峰在281 nm，荧光寿命为4.67 ns，与单一BSA的2(≈4.4 ns)十分接近；加入甲啶铂的BSA的荧光寿命2=4.2 ns，小于Phe的4.67 ns，且小于甲啶铂的寿命2。推测甲啶铂与BSA中的Phe残基可能发生了相互作用。

3 结论

1) 采用稳态荧光光谱测定，当加入甲啶铂后，BSA荧光发射峰从335 nm最大红移到337.5 nm。伴随着荧光强度的猝灭，荧光猝灭程度的波动与甲啶铂自身的荧光波动有关，推测甲啶铂对BSA的猝灭为静态猝灭。

2) 采用时间分辨荧光光谱测定，用单指数拟合方法得到对应的荧光寿命，加入甲啶铂后的BSA溶液荧光寿命的微小变化符合猝灭的静态性质。

3) 加入甲啶铂后，在335 nm测量，采用双指数拟合法得到BSA的2个荧光寿命分别为2.5和6.3 ns，分别对应BSA在第212位和第134位的Trp残基；由于荧光寿命明显缩短，可以判断甲啶铂与212位的Trp残基发生作用。在281 nm测量计算得到的荧光寿命数值表明，加入甲啶铂后，BSA中Phe的荧光寿命减小。表明BSA中第212位Trp残基是甲啶铂的靶向目标，BSA中的Phe残基也可能与甲啶铂发生作用。

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Fluorescence Spectroscopy Study of the Interaction between Picoplatin and Bovine Serum Albumin

PENG Juan1, 2, DING Hao3, YE Man-ping3, HU Jing1, PU Shao-ping2 *, CONG Yan-wei2, WANG Ying-fei2

(1. Faculty of Materials Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650093, China;2. Guiyan Pharmaceutical Co. Ltd., Kunming 650106, China;3. College of Optical and Electronic Technology, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China)

The interaction between picoplatin and bovine serum albumin (BSA) in aqueous solution was studied by steady-state fluorescence spectroscopy and time-resolved fluorescence techniques. With the introduction of picoplatin, the fluorescence emission peak of BSA redshifted from 335 nm to 337.5 nm, accompanied by the quenching of fluorescence intensity, indicating that there was interaction between picoplatin and BSA. The single exponential fitting of the fluorescence decay confirmed that the quenching of the BSA by picoplatin is static. The double exponential fitting of the fluorescence decay indicates that the intrinsic fluorescence of BSA is mainly contributed by the tryptophan (Trp) residues at the 212thand 134thpositions. The 212thTrp residue and the phenylalanine (Phe) residue in BSA may be the targets of picoplatin.

picoplatin; bovine serum albumin(BSA); steady-state fluorescence; time-resolved fluore- scence; fluorescence lifetime

O657.3

A

1004-0676(2020)01-0031-06

2019-07-17

云南省科技计划项目(2016DH008，抗肿瘤新药仿制创新与成果转化核心技术平台)

彭 娟，女，高级工程师，研究方向：铂类抗肿瘤药物的研究和开发。E-mail：ynpengjuan@163.com

普绍平，男，高级工程师，研究方向：铂类抗肿瘤药物的研究和开发。E-mail：pushaoping@163.com