正交法优化产甲烷混合菌超低温保护剂

谭凯丽，赵 晗

（1.煤与煤层气共采国家重点实验室，山西 晋城 048000；2.易安蓝焰煤与煤层气共采技术有限责任公司，山西 晋城 048000）

近年来，煤炭生物转化技术逐渐受到重视，国内外诸多学者陆续开展了煤炭生物成气的相关研究[1-3]，并在实验室条件下以煤为底物，通过接种高效产甲烷混合菌群进行模拟成气实验，获得良好的产甲烷效果[4-5]。在实验室环境下进行煤炭生物气化实验时，菌群结构稳定、产甲烷效果良好的混合菌对煤炭生物气化实验起着关键作用[6]。目前，微生物菌种的保藏多为单菌种的保藏，关于混合菌群的保藏鲜见报道。而根据经典厌氧发酵理论[7-8]，参与到产甲烷气过程中的微生物主要为水解发酵型细菌、产氢产酸菌及产甲烷菌，这些混合菌共同作用于煤基质而产生生物煤层气。曾有学者对山西寺河矿区121 煤层气井产出水样中的菌群进行保藏实验，得出菌群保藏的最佳条件为25 ℃下的煤基-基础盐配方，此方法保藏的产甲烷菌群能长期维持在较高的活性状态，保持较好的产甲烷能力[9]。

微生物菌种保藏方法很多，冷冻干燥保存法和冷冻保存法是目前公认的长期保存微生物菌种的最安全、可靠的方法。其中冷冻保存法中的液氮超低温保存法适用范围广，可用于大多数微生物，特别是不适合用冷冻干燥保存法保存的微生物，因此该方法已经成为长期保存微生物菌种的最佳方法[10]。许多研究表明[11]，在低温保藏细胞和组织时，添加保护剂比不添加保护剂的保藏效果更好。适当浓度的保护剂进入细胞内可避免细胞膜冷冻损伤，添加了保护剂的菌种冷冻后，可以保持较高的存活率[12]。

海藻糖、甘油、二甲基亚砜作为常用的保护剂，在低温生物医学领域被广泛使用[13]。根据保护剂在深低温保存中的作用可以分为两大类：渗透性和非渗透性保护剂。其中二甲基亚砜和甘油为渗透性保护剂，海藻糖为非渗透性保护剂。渗透性保护剂多属于低分子中性物质，在溶液中优先同水分子相结合，增加溶液的黏性，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。非渗透性保护剂通常分子量较小，能溶于水，但不能进入细胞，在降温时主要与渗透性保护剂联合使用，促使细胞完成脱水，同时还具有中和渗透性保护剂毒性的作用。

本文采用正交实验设计法，选用L9（34）正交表，以产甲烷混合菌群为实验对象，海藻糖、甘油和二甲基亚砜作为保护剂，优化了超低温保藏产甲烷混合菌群保护剂配比。

1 实 验

1.1 实验材料

菌种来源于山西沁水某煤层气井，通过收集煤层气井口排采水获得含有产甲烷菌群水样，将水样装入厌氧瓶后，放入冰块带回实验室。采集来的水样添加产甲烷培养基和无烟煤煤块后放入200 L 厌氧发酵罐中，在35 ℃富集培养，定期排掉菌液后添加同等体积新鲜培养基[14]。保藏实验进行前，菌液在发酵罐内稳定产气，甲烷体积分数维持在15%左右。

培养基采用无菌无氧产甲烷培养基：在1 L 去离子水中，依次加入磷酸二氢钾1.5 g、磷酸氢二钾2.9 g、氯化铵0.4 g、氯化镁1.8 g 和酵母抽提物2.0 g，在电炉上加热至沸腾，冷却后加入半胱氨酸，调节pH 值至7，加入质量分数1%刃天青，装上定量分液器后通氮气，加热培养基至沸腾、无色，在微沸状态下煮15 min～30 min，在通氮气的情况下冷却，定量分装到厌氧瓶内，用铝盖封口后高温灭菌备用。

保护剂：海藻糖、甘油、二甲基亚砜。

1.2 实验方法

1.2.1 正交实验设计

为得到最佳产甲烷混合菌群保护剂配比，以海藻糖、甘油、二甲基亚砜作为研究对象，选用L9（34）正交表进行正交实验，因素水平表见表1。

表1 因素水平%

1.2.2 产甲烷混合菌的培养及收集

实验进行前，将发酵罐内50 mL 混合菌液接入250 mL无菌无氧的产甲烷培养基内混合均匀，于500 mL 厌氧瓶中35 ℃恒温培养。产甲烷混合菌的生长情况以600 nm 处的光密度值（OD600）评价。定期检测转接菌液实验组及空白对照组OD600值。产甲烷混合菌转接后OD600值变化图见图1。由图1 可知，菌液转接至500 mL厌氧瓶24 h 后，OD600值有下降趋势，因此，产甲烷混合菌在接种24 h 后，进行产甲烷混合菌的保藏实验。

图1 产甲烷混合菌转接后OD600 值变化图

1.2.3 产甲烷混合菌的保藏实验

按照实验设计进行正交实验，将培养24 h 的混合菌液置入厌氧工作站（英国DWS DG1000）中，通过注射器接入事先通氮气除氧的离心管，拧紧瓶盖后10 000 r/min 离心20 min，再次放入厌氧工作站中，弃上清液，按照相应浓度加入保护剂后放入耐低温冻存管，进行液氮超低温保藏。

1.2.4 存活率的测定

将存有产甲烷混合菌的冻存管在液氮中保藏48 h后，室温下静置2 h，用血球计数板计数并计算存活率，存活率计算公式见式（1）：

1.2.5 产甲烷浓度测定

将计数后菌液按照组别，以体积比1∶5 接入无菌无氧培养基中，35 ℃恒温培养，7 d 后测定甲烷体积分数。

2 结果与分析

2.1 因素指标分析

正交设计及数据和正交实验结果分别见表2、表3。

表2 正交设计及数据

表3 正交实验结果

从表3 实验结果可知：对于存活率，因素主次关系为甘油质量分数＞二甲基亚砜质量分数＞海藻糖质量分数，保护剂最佳组合为质量分数10%甘油+ 质量分数 7%二甲基亚砜 + 质量分数 10%海藻糖（B2C2A1）。对于产甲烷体积分数，因素主次关系为二甲基亚砜质量分数＞甘油质量分数＞海藻糖质量分数，保护剂最佳组合为质量分数3%二甲基亚砜+ 质量分数6%甘油+质量分数10%海藻糖（C3B1A1）。

这是因为煤的厌氧生物降解需要不同代谢功能的多种微生物菌群相互配合来完成，在进行冷冻保藏的过程中，不同的菌群对于低温、氧气的适应性也不尽相同，产甲烷菌为一种严格的专性厌氧微生物，对氧气敏感度较高，而其他微生物均为兼性厌氧微生物，可承受一定浓度范围的氧气。有研究表明[15]，作为保护剂，甘油对特定类型细胞非常有效，而二甲基亚砜使用更为广泛，对所有的细胞类型都很有效。但本实验结果显示，甘油保护剂的添加，对整体菌群存活率有所提高，二甲基亚砜则更利于产甲烷菌的存活。

2.2 方差分析

冷冻保护剂方差分析结果见表4 和表5。表4 和表5 表明，3 种保护剂对冷冻存活率及产甲烷的影响均不显著。

表4 冷冻保护剂方差分析结果（存活率）

表5 冷冻保护剂方差分析结果（甲烷体积分数）

2.3 最优化结果验证

以产甲烷体积分数作为最终参考指标，进行验证实验，结果见表6。

表6 验证实验结果

以C3B1A1（质量分数3%二甲基亚砜+ 质量分数6%甘油+ 质量分数10%海藻糖）为产甲烷混合菌保护剂，进行低温冷冻保藏，活化后其产甲烷体积分数达到了13.05%。

3 结 论

添加了保护剂的实验组经液氮超低温保藏后，其产甲烷能力优于不添加任何保护剂的实验组。产甲烷混合菌未加保护剂实验组在直接冷冻的情况下，其存活率为13.04%，且产气实验后甲烷体积分数偏低；而添加了保护剂的实验组其存活率为39.13%，并且产气实验后甲烷体积分数相对较高（13.05%），是不添加保护剂的对照组（0.41%）的32 倍。