Klotho基因在神经变性病中的研究进展

徐敏，叶民

1997年日本学者Kuro-O等[1]在进行自发型高血压的相关性研究时偶然发现一种新型基因，经过一系列的实验证实其与衰老有关，缺失这种基因的小鼠会出现寿命缩短、动脉硬化、皮肤肌肉萎缩、认知障碍、运动神经元受损等症状。之后Kuro-O等[1]便采用古希腊神话中纺织生命之线的女神名字——Klotho(Kl)命名此基因。

小鼠的Kl基因转录产物约5.2 kb，长度与人类相似。Kl根据选择性剪切产物转录为跨膜型和分泌型Kl蛋白，其中分泌型的表达量明显高于跨膜型。跨膜型Kl蛋白全长有1 024个氨基酸残基，包含N末端信号序列、胞外区域、单跨膜螺旋区域和短胞内区域。胞外区域又分为重复序列Kl1和Kl2。而分泌型Kl蛋白无Kl2、跨膜区域和细胞内区域，仅编码Kl基因N末端一半的区域，约550个氨基酸。

Kl蛋白具有多种生物学活性，一方面跨膜型Kl蛋白可与成纤维细胞生长因子受体(FGFR)作为FGF23的共受体，介导FGF23的生物学活性[2];另一方面分泌型Kl蛋白有抵抗氧化应激、抑制细胞炎症和凋亡[3-6]、促进血管发生[7-8]等作用。近来研究[9]发现，Kl基因的一种功能性单倍型(Kl-VS)，能改变细胞Kl蛋白的分泌及功能，它由两个非同义变异体rs9536314(R352V)和rs9527025(C370S)组成，Kl-VS杂合子(Kl-VSHET+)与血清Kl水平升高相关，而Kl-VS纯合子则与Kl血清水平降低相关。

以往研究[1]认为Kl基因在肾脏远曲小管和大脑脉络丛中的表达最高，其次是脑、甲状旁腺、胰腺、卵巢、睾丸等，最近的研究[10]发现，Kl基因敲除小鼠的神经变性程度会明显增加，主要包括胆碱能功能改变、多巴胺能神经元和海马神经元减少、浦肯野细胞减少以及氧化应激升高等。关于Kl在CNS中具体发挥的作用、作用机制无统一定论，Kl与神经病学尤其是神经变性疾病的关系受到国内外专家学者越来越多的重视，特别是Alzheimer’s病(AD)和帕金森病。因此，本文就目前国内外对Kl与神经变性病关系的研究进行总结，希望能使更多的同仁认识到Kl基因的重要性，为治疗神经变性病提供新的思路。

1 Kl与AD

AD是一种发生在老年和老年前期、以进行性认知功能障碍为特征的神经系统变性疾病。临床上通常表现为记忆障碍、失语、失用、人格和行为改变等。其病理学上的典型改变为β淀粉样物质(Aβ)在神经细胞外沉积形成的神经炎性斑和过度磷酸化的tau蛋白在神经细胞内聚集形成的神经原纤维缠结。

1.1 表现形式Kl基因在大脑皮质和海马神经元中广泛表达，随着年龄增长蛋白浓度逐年降低，Kl联系着学习和记忆功能，过表达Kl的个体具有认知下降较慢、执行功能更好的表现。Massó[11]早前比较过携带家族性AD突变基因PS1/M146V、AβPPSwe和tauP301L的3xTg-AD模型小鼠与健康对照小鼠在不同月龄时分泌的Kl蛋白水平，发现随着年龄的增长两种小鼠的Kl蛋白水平在前额叶皮质、大脑皮质、海马中均有下降，3xTg-AD小鼠下降则更明显，18个月与6个月相比各区中分别降低了41%、49%、63%，这再次证明Kl在生物体内随着年龄增高而减少的现象，且在认知相关区域下降更明显。这意味着Kl如果能维持CSF浓度在一个较高水平可能是有助于减缓认知下降的，而这一过程可能与它能对抗Aβ累积后对脑组织造成的负担有关。

有研究[12]报道，Aβ在脑内积聚可由载脂蛋白E4(APOEε4)等位基因造成，在Kl-VSHET+(即血清Kl水平升高状态)中，APOE ε4阳性个体的血清Aβ负荷与APOE ε4阴性个体相比未见增高，且在CSF中表现更明显。Kl-VSHET+可以降低携带APOEε4患者的Aβ负荷[13-14]。Belloy等[14]进行荟萃分析总结了这一现象，在携带APOEε4的个体中，60～80岁表现为Kl-VSHET+状态与降低的Aβ负荷、AD风险有关，从80岁开始Kl-VSHET+的健康对照组转化为轻度认知功能障碍期或AD的风险会降低。

1.2 病理联系 Kl蛋白缺乏时海马神经元会出现突触减少及神经变性的病理表现，海马透明层中与学习和记忆建立有关的神经元单个的大小及突触小泡个数虽然正常，但整体突触数量显著下降[15]，并且还伴随有海马轴突运输障碍及神经变性增加的现象[16]。不仅如此，Vo等[17]发现此时海马神经元细胞的形态是发生了改变的，表现为树突棘头部直径增大、长度变短。这种异常细胞形态更容易对刺激做出反应，当体内存在高频刺激时神经元网络反应会普遍增加，海马长时程增强容易达到饱和，之后便难以实现编码记忆所需的突触电位特异性增强，学习和记忆能力就会受到损害。

而Kl基因表达增加也是可以通过病理改变来协助学习和记忆的编码的，事实上，学习和记忆的形成主要是通过刺激N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)亚单位GluN2B实现的，海马NMDAR参与长时程增强的诱导过程，而长时程增强是长时程记忆的细胞相关因子，因而NMDAR作为长时程记忆建立的重要基础发挥着关键作用。研究[18]发现，Kl过表达会使海马和皮质中突触后的GluN2B密度翻倍，也会使NMDAR依赖性基因Fos表达增加。这一类观察对象明显右背外侧前额叶皮质体积更大、认知下降更慢[19]、执行功能更好[20]。

1.3 保护机制 Kl蛋白对海马神经元细胞发挥着强大的保护作用，从机制出发，它能有效阻止人类淀粉样蛋白前体蛋白对细胞造成损害，改善转基因小鼠表现出的学习与记忆功能障碍[21]。其过程复杂，研究发现它不仅能显著提高硫氧还蛋白/过氧化物酶氧化还原系统的表达[22]，而且能通过下调Wnt1水平、上调磷酸化环腺苷酸反应元件结合(pCREB)、核因子红细胞2-相关因子2和血红素加氧酶1的mRNA水平，减轻Aβ暴露细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应[3]。

因而不论是在症状表现、生理水平还是病理或分子机制上，Kl都表现出与AD的明显相关性。提高Kl浓度，保护海马神经元，势必会为AD患者带去益处。只是其所伴随的风险还需要继续研究。对抗Aβ负荷是其发挥保护作用的关键。这也意味着其过表达对认知正常青年个体没有提升认知或智力的能力。

2 Kl与帕金森病

帕金森病是一种发病率仅次于AD的复杂神经变性疾病，病理机制涉及到黑质致密区多巴胺能神经元及其他含色素的神经元的大量变性和丢失。其临床表现主要包含两方面，一为运动功能障碍，包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直及姿势步态障碍，另一为非运动症状，包括睡眠、认知及嗅觉障碍和疲劳等。

2.1 表现形式 研究[23-24]显示，Kl基因在纹状体(SNC)内有广泛表达，随着年龄逐渐增长，Kl蛋白功能下降会导致SNC中酪氨酸羟化酶(TH)阳性多巴胺能神经元的数量明显下降、体积明显缩小，继而神经元变性失活，多巴胺合成明显减少。

2.2 病理联系 Kosakai等[24]发现，TH阳性多巴胺能神经元数量下降这一病理特征能被维生素D(VitD)限制摄入所改善。推测相关生理机制可能如下：Kl与FGF23协作负性调节VitD生物合成，而VitD可促进TH基因表达[25]，TH作为儿茶酚胺生物合成途径中的第一限速酶，其表达可调节儿茶酚胺分泌速率和儿茶酚胺能途径中神经传递的有效性[26]，即Kl强效抑制着VitD合成进而限制多巴胺的合成。因而考虑Kl蛋白减少导致活性VitD异常增加造成多巴胺能神经元变性这一路径可能是帕金森病一种新的发病机制，值得深入研究。然而，Evatt等[27]却发现了帕金森病患者中VitD缺乏的普遍性，认为补充VitD可以保护SNC多巴胺能神经元[28]。目前许多学者在着力于VitD缺乏与帕金森病的关系研究，其具体机制不明，考虑是过表达的Kl造成的VitD减少，但与帕金森病好发年龄即主要研究对象不相符。以上两种矛盾结果是否均与Kl有关，Kl是如何变换其在帕金森病发病中的角色，如何激发其在帕金森病中发挥保护作用，有待进一步深入研究。

2.3 保护机制 进行Kl与帕金森病相关性机制研究时有人发现Kl蛋白可通过多种通路对抗氧化应激，发挥保护多巴胺能神经通路的作用。Kl过表达可通过信号调节激酶1信号复合物产生减轻p38 MAPK介导的氧化应激的效果，活性氧敏感信号事件受到影响，多巴胺能神经元便不易受到活性氧介导的氧化应激的损害[4]。除此以外，Kl还能增强pCREB信号、cAMP依赖性蛋白激酶A或钙/钙调素依赖激酶Ⅱ级联信号的激活及磷酸化，对SNC多巴胺能通路发挥神经保护作用[5]；促炎细胞因子的产生及免疫生成样表型DNA的损伤也会减少[6]。

3 其他

目前除对AD、帕金森病等研究较多外，还有少数学者针对其他神经变性病做出了探索。Zeldich等[29]发现Kl过表达能保护小鼠运动神经元细胞，使肌萎缩侧索硬化疾病的开始、进展和存活时间分别延长约6 d、11 d、11 d；而Kl基因缺失小鼠具有与经典肌萎缩侧索硬化患者相似的病理表现，Anamizu

等[30]观察到野生型小鼠颈髓腹侧灰质神经元细胞的密度、平均神经元核仁直径均明显大于Kl基因缺失小鼠，Kl基因缺失小鼠在脊髓前脚运动神经元细胞生成过程中存在明显障碍；与此同时，细胞质RNA的明显下降与粗面内质网池的缩小最终造成运动神经元细胞功能的失调。Guo等[31]发现，多系统萎缩患者血清中Kl蛋白浓度也呈下降趋势，与年龄负相关。Shiozaki等[16]发现，Kl蛋白对野生型小鼠的浦肯野细胞具有保护作用，Kl基因缺陷小鼠小脑中的浦肯野细胞体有类似于脂褐素型颗粒的异常内含物，轴突显示出退化迹象，因而脊髓小脑性共济失调的发病可能与此有关。

4 共同作用机制

针对Kl在AD、帕金森病的机制研究，不难发现，对抗氧化应激是Kl蛋白对CNS保护机制中最重要的一项，包括提高硫氧还蛋白/过氧化物酶氧化还原系统的表达、减轻活性氧系统的损害等。然而具体机制研究是个大工程。Abraham团队一直致力于Kl基因的研究，近两年在激活Kl基因的表达方面有了明显进展，他们发现在Kl基因启动子区-300～1 bp范围内，靶向Kl启动子区的单导RNA(sgRNA)存在两种能够有效增强Kl基因转录的序列，分别为sgRNA 3(序列：5′-GGT GCC TTT CTC CGA CGT CCG-3′；反序列：5′-CGG ACG TCG GAG AAA GGC ACC-3′)及sgRNA 4(序列：5′-GGA AAC GTC CTG CAC GGC TCC-3′；反序列：5′-GGA GCC GTG CAG GAC GTT TCC-3′)[32]。他们还发现使用针对Kl启动子-250 bp和Egr1结合位点之一重新设计的锌指蛋白也可以特别激活Kl基因[33]。这一发现不仅有助于Kl基因的表达，获取更多的Kl蛋白，便于研究其在不同疾病中的作用机制，更是为后续在生物体内特异性激活研究治疗途径奠定了基础。

5 总结与展望

Kl是一种衰老抑制基因，与人类神经系统变性病关系密切。已有的各项研究表明，Kl在AD、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、多系统萎缩等神经变性病中表达均下降，Kl过表达对CNS具有明显的保护作用。对于AD，Kl竭力对抗Aβ对海马神经元造成的损害，细胞层面上能显著改善长时程记忆基础中的NMDAR结构功能和网络反应敏感性，分子层面上能调节硫氧还蛋白/过氧化物酶氧化还原系统、pCREB、核因子红细胞2-相关因子2和血红素加氧酶1、Wnt1等的表达；对于帕金森病，Kl负性调控VitD合成以保护多巴胺能神经元，维持多巴胺的正常合成和分泌，这一过程主要是增强了信号调节激酶1信号复合物、pCREB、cAMP依赖性蛋白激酶A、钙/钙调素依赖激酶Ⅱ等信号的表达；Kl还能保护脊髓前脚运动神经元，监控细胞形态和功能完整；其他类似于肌萎缩侧索硬化、多系统萎缩的发病过程似乎都有Kl保护者的身影。除以上作用外，Kl对神经变性病保护机制的共同之处也是最重要的一点即是抵抗氧化应激对神经细胞造成的损害。

尽管目前大多证据均显示着Kl的积极作用，但不足以充分证明它的意义所在。它对大脑功能所发挥的作用仍布满迷雾，需要更多的证据来证明相关性。其与亨廷顿病、路易体痴呆、进行性核上性麻痹等的关系的研究现在一片空白。其具体调节机制如何，如何激活它在人体内的保护作用，是否存在隐患，许许多多的问题都等待着解决。需要更多更深入的研究来剖析，需要更多的研究者投身其中。

尽管Kl的角色尚未清晰，但我们依然有理由相信，Kl在未来可以为神经变性病乃至CNS疾病提供一种有前途的治疗方法。