K-Cl协同转运蛋白2在脊髓损伤和癫痫中的研究进展

程颖颖，赖国钢，金力，刘胜兵

离子通道电信号与细胞膜上的离子泵产生的离子浓度梯度相关。阳离子-氯离子协同转运蛋白(CCCs)属于溶质转运蛋白家族12(SLC12)成员，在控制神经元细胞内外的离子环境中有重要作用[1-3]。K-Cl协同转运蛋白(KCC)属于CCCs家族，其亚型包括KCC1～KCC4，主要调节K+和Cl-的跨膜转运，在细胞容积和离子稳态的调节中发挥作用。KCC2由位于染色体20q13.12上的SLC12A5编码，有两种主要的蛋白编码剪接异构体，即KCC2a和KCC2b[4]。KCC2由溶质载体12家族(SLC12A5)的第五个成员编码，能产生神经元内超极化的Cl-梯度，主要表达于神经元，包括皮质细胞和多种抑制性神经元间亚类(小脑颗粒细胞、丘脑中继细胞以及听觉脑干、嗅球和脊髓中的神经元)。在人体组织方面，KCC2蛋白出生时就已高度表达；在小鼠中，KCC2b的表达在发育过程中表达增加明显，是成年小鼠大脑中最丰富的亚型。黑质多巴胺能细胞和丘脑网状核内大部分神经元缺乏KCC2，KCC2a的表达在整个生命过程中上调较少。KCC2是维持神经元Cl-稳态的关键因素，其功能障碍和失调是许多神经系统疾病发生和发展的关键因素，但KCC2在神经系统疾病的发展和严重程度方面的作用和功能尚不完全清楚。随着近年来测序和特定基因靶向技术的发展，KCC2被发现与许多神经系统疾病有关，包括脊髓损伤(SCI)痉挛、癫痫和精神分裂症等。在这些神经系统疾病治疗中，KCC2是有效的治疗靶点候选，明确调控KCC2表达的机制具有重要意义。本文就KCC2在SCI痉挛和癫痫发生及治疗中的相关作用机制进行综述。

1 KCC2与脊髓损伤痉挛

肢体痉挛是SCI后由运动神经元改变引起的反射亢进现象，是一种以反射亢进和肌肉僵硬为特征的运动障碍，目前临床治疗效果不理想。SCI痉挛与电压门控钠通道的钙依赖性蛋白水解、运动神经元持续的钠电流(I NaP)的上调存在密切关系，钠通道和KCC2的蛋白水解裂解是SCI后痉挛发生的上游机制[5]。SCI影响下行传导通路，SCI下方脊髓回路通过下调KCC2表达、改变运动神经元膜离子通道和增加I NaP来进行适应性应对。这些应对可导致运动神经元兴奋性提高，从而引发痉挛。SCI导致脊髓反射性亢奋和突触抑制减少，常与痉挛相关。GABAA受体介导的抑制依赖于细胞内低水平Cl-浓度的维持[6]，而细胞内低水平Cl-浓度在成人中依赖于神经元特异性KCC2，其可将胞内的 Cl-有效运输到胞外。通过诱导KCC2表达改变相关神经元兴奋性，可以减轻SCI后痉挛。从高通量筛选中识别出的选择性KCC2激动剂——CLP290可促进输入信号从大脑向腰椎的下行传输，在交错脊髓损伤和抑制性神经元间，将脊髓损伤引起的脊髓回路功能障碍转化为一种功能状态，促进脑源性指令向腰椎的传递。而氯氮平-N-氧化物(CNO)激活特定药物激活受体(DREADD)和通过选择性表达KCC2也可达到相类似的治疗效果，KCC2激动剂可能是促进脊髓损伤后功能恢复的方法[7]。研究显示，基因治疗结合运动可以有效恢复大鼠KCC2表达，改变脊髓中间神经元和运动神经元的兴奋性，减轻脊髓损伤后肌肉痉挛。研究采用编码人类神经营养因子3腺相关病毒(AAV-NT3)对脊髓T9受到严重挫伤的大鼠模型进行基因治疗，并在受伤4周后进行2周的运动训练，AAV-NT3基因治疗、运动和联合治疗均能降低脊髓损伤后6周游泳测试中痉挛的频率，并增加H反射的速度依赖性抑制。联合治疗组大鼠KCC2表达的恢复明显优于运动组，在保护运动神经元、重建脊髓神经元方面明显优于单纯的AAV-NT3基因治疗组，表明AAV-NT3基因治疗与运动结合可以通过改变脊髓间神经元和运动神经元的兴奋性，减轻脊髓损伤后肌肉痉挛[8]。该研究提示可通过基于个体化药物的联合运动疗法来提高KCC2表达，减少脊髓损伤后的痉挛。神经元KCC2的表达降低，可促进SCI大鼠痉挛的发生。虽然运动可以降低脊髓过度兴奋性，增加脊髓损伤后腰椎运动神经元KCC2的表达，但二者之间的因果关系尚不明确。活动相关的过程包括脑源性神经营养因子(BDNF)表达的增加。BDNF不仅是KCC2的调节因子，也是脊髓兴奋性的有效调节因子。酪氨酸激酶受体B(TrkB)属于酪氨酸激酶受体家族，其配体为BDNF。BDNF与TrkB结合，TrkB通过二聚体化及胞内激酶区特异性酪氨酸残基磷酸化而激活。研究发现，SCI大鼠在4周的日常康复过程中接受KCC2阻断剂VU0240551或BDNF清除剂TrkB-IgG，受伤后4周H反射的频率依赖性抑制，表明KCC2活性依赖的增加在功能上有助于H反射的恢复，并在很大程度上依赖于BDNF活性[9]。重复经颅磁刺激(rTMS)治疗后，rTMS可能通过BDNF发挥间接作用。研究显示，高频rTMS可以增加BDNF，增强BDNF-TrkB信号通路[10]。BDNF可以增加运动神经元的兴奋性，BDNF-TrkB途径的激活降低KCC2表达，降低神经元传递氯离子的能力，从而抑制GABA能的传递。对正常大鼠脊髓使用外源性BDNF能降低KCC2蛋白水平，导致类似SCI后KCC2蛋白表达变化[11]。BDNF在正常情况下可以降低KCC2蛋白的表达，但在神经损伤时BDNF可提高KCC2蛋白的表达，神经损伤逆转了BDNF对受损神经元的作用[12]。高频rTMS对脊髓损伤后KCC2蛋白表达有影响。有研究建立SD大鼠SCI模型发现，10 Hz rTMS可以缓解SCI大鼠的痉挛，这可能与KCC2蛋白上调有关。提示脊髓损伤早期高频rTMS治疗可能取得更满意的疗效[13]。诱导KCC2表达结合运动或其他相关因子间接提高KCC2表达，对SCI痉挛的缓解或更有效果。

KCC2能维持成熟神经元细胞内抑制所需的低氯水平，其功能障碍导致的Cl-输出损伤涉及到许多神经系统疾病，包括SCI后的癫痫发作、神经性疼痛或痉挛。这使得KCC2成为在病理条件下恢复Cl-稳态和抑制的理想药物靶点。常规抗精神病药物吩噻嗪衍生物是KCC2活动的增强剂。其中，丙氯拉嗪使新生大鼠运动神经元Cl-平衡电位超极化，恢复SCI后的相互抑制。传统的抗精神病药物吩噻嗪可缓解慢性成年SCI大鼠的痉挛，其疗效相当于抗痉挛药巴氯芬，并能抑制SCI诱导的损伤下方运动神经元中KCC2的下调。SCI后痉挛和神经系统疾病(包括KCC2功能障碍)是丙氯拉嗪的一种新的治疗适应症[14]。由于细胞内Cl-浓度较低，GABAA和甘氨酸受体激活抑制神经元，而KCC2可维持细胞内氯离子浓度。由于KCC2维持着较低的细胞内Cl-浓度，因此当GABAA受体被激活时，Cl-在神经元内流动，具有超极化(抑制)作用。SCI可下调KCC2，逆转Cl-的流动。在这些条件下，与GABAA受体的结合可产生去极化(兴奋性)效应，促进疼痛敏感化的发展。SCI后，给予GABAA拮抗剂可以阻止辣椒素诱导的疼痛敏感化发展，GABA的释放起着重要的作用。这种兴奋作用与5-HT能纤维有关，5-HT能纤维通过背外侧索神经(DLF)下行，通过5HT-1a受体影响脊髓功能。阻断5-HT-1A受体或损伤DLF可以模拟SCI的作用[15]。KCC2在SCI后的下调，分别抑制运动神经元和背角间神经元，引起痉挛和神经性疼痛。4-溴-3,6-二甲氧苄环丁烯酮-1-酰基(TCB-2)对5-HT2A受体的特异性激活可上调KCC2功能，恢复运动神经元抑制，降低SCI诱导的痉挛[16]。Cl-逆转电位在大鼠脊髓神经元中的变化以前曾与神经损伤和炎症模型中的持续性疼痛相关。这些变化与KCC2表达的减少以及神经元兴奋性的增加有关，即在三叉神经眶下神经慢性收缩损伤引起神经性疼痛(CCI-ION)的小鼠中也会发生类似的变化。在CCI-ION小鼠模型中，氯离子失调可能在导致慢性疼痛维持的中枢机制中没有显著作用[17]。研究发现，大鼠脊髓损伤后KCC2表达下调，尤其是在运动神经元膜上，Cl-平衡电位去极化，降低突触后抑制的强度。在脊髓未损伤的大鼠中，阻断KCC2可减少Hoffmann反射的速度依赖性抑郁(RDD)。KCC2缺陷大鼠和正常大鼠在鞘内注射下调KCC2的BDNF后，RDD也降低。SCI时消除BDNF可以防止SCI后KCC2的早期下降；相反，SCI后BDNF上调KCC2并恢复RDD。这一结果为缓解痉挛的治疗开辟了新的方向[11]。动物实验发现，脊髓横断后KCC2活性下调可以导致GABA和甘氨酸的抑制作用转变为兴奋作用[18-19]。速尿是一种公认的动物KCC2拮抗剂，可阻断脊髓运动神经元中抑制性突触后电位的形成，不影响兴奋性突触后电位。基于动物实验推测，速尿可能用于揭示人类脊髓损伤后KCC2的下调，这有助于反射性超兴奋性。速尿在不改变单突触兴奋性传递的情况下，可降低健康受试者的突触前和突触后抑制，表明速尿可能用于人类评估脊髓抑制性突触。脊髓损伤后速尿缺乏提示人KCC2功能障碍导致脊髓神经元抑制性突触传递减少[20]。KCC2功能障碍可能是脊髓损伤后高反射的一个重要病因。这些发现可能为以氯稳态为中心的治疗痉挛的新策略提高思路。

有研究显示，组蛋白低乙酰化参与神经性疼痛的发生和维持[21-22]。因此，许多天然和合成的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂在动物实验上显示出显著的镇痛作用。有研究发现，坐骨神经损伤后大鼠腰脊髓HDAC2 mRNA和蛋白水平升高，鞘内注射泛HDAC抑制剂曲古抑菌素(TSA)可抑制HDAC2蛋白的升高，并具有剂量依赖性的镇痛作用。通过慢病毒载体将HDAC2特异性shRNA导入脊髓发现，HDAC2敲除后，坐骨神经慢性缩窄性损伤(CCI)大鼠脊髓中谷氨酸脱羧酶-65和KCC2表达升高。研究证实，HDAC2参与了外周神经损伤引起的机械和热痛觉过敏，谷氨酸脱羧酶-65和KCC2可能是HDAC2在疼痛调节通路中的下游靶点[23]。骨癌疼痛大鼠模型中，HDAC抑制剂TSA通过恢复μ型阿片肽受体表达对机械痛觉过敏起镇痛作用，进一步在PC12细胞中敲除HDAC2，未恢复μ型阿片肽受体表达，却逆转了KCC2表达的下调，骨癌疼痛大鼠模型脊髓中的HDAC2参与了机械痛觉过敏，这种作用可能与KCC2的调节有关[24]。

2 KCC2与癫痫

癫痫研究最重要的目标之一是确定潜在的癫痫发作机制。CNS的主要抑制性神经递质是GABA。GABA通过激活Cl-渗透性GABAA受体通道(GABAAR)使膜电位去极化。KCC2可使神经元维持较低的细胞内Cl-水平，这是有效抑制突触的先决条件。癫痫患者的KCC2活性明显降低，是否直接导致了潜在的病理生理学仍然存在争议。有研究发现，KCC2中的苏氨酸906和1007突变为丙氨酸(KCC2-t906a/T1007A)，这可以防止其磷酸依赖性失活。KCC2-t906a/T1007A小鼠基础神经元Cl-外流增加，KCC2的总量和质膜积累未改变。突变小鼠中，活性诱导的突触抑制缺陷被减少，KCC2的增强足以限制化学惊厥诱发的癫痫样活动。此外，KCC2功能的增加减轻了癫痫期间异常高频活动的诱导，因此增强KCC2代表一种治疗策略，可以减轻癫痫[25]。在面对过度的神经网络活动时，提高主要神经元维持跨膜Cl-梯度能力可以防止中间神经元参与癫痫的持续发作[26]。难治性癫痫患者脑组织NKCC1和KCC2基因表达水平异常。有研究发现，耐药性颞叶癫痫患者KCC2表达水平显著降低[27]。这一发现也与微观结构变化显著相关，KCC2的下调和微观结构异常可能导致颞叶癫痫的复发。最近一项完整的外显子组研究发现了癫痫患者的几个致病突变，KCC2可以作为相关治疗靶点[28]。这两项独立的研究提供了初步证据，表明KCC2突变影响转运蛋白功能，并使人类易于发生癫痫。在一个澳大利亚发烧痉挛家庭中发现了一种KCC2(SLC12A5)基因变异[29]，数例带有隐性SLC12A5功能丧失突变的患者伴有严重的小儿癫痫发作综合征及婴儿期移行性局灶性癫痫。全外显子组测序发现，KCC2中有6个额外突变可导致婴儿期移行性局灶性癫痫[30]。动物实验进一步证实了KCC2功能降低可能导致癫痫发作，KCC2基因(SLC12A5)完全缺失的小鼠出生时由于受损的GABA抑制脊髓导致呼吸衰竭，会立即死亡[31]。最近的一项完整的外显子组研究发现，KCC2是有潜力的治疗靶点[28]，但大多数癫痫患者不携带KCC2突变。然而，慢性颞叶癫痫患者切除的组织可以观察到去极化的GABA能神经元-氯离子共转运蛋白的传递和活性的改变[32]，这与KCC2 mRNA和蛋白表达的降低有关[33-34]。与特发性癫痫患者相比，一些脑损伤也可引发癫痫，这些损伤包括神经胶质瘤、创伤性脑损伤等。脑胶质瘤可高度致癫痫，兴奋性谷氨酸能机制参与了神经胶质瘤周围新皮质癫痫活动的产生，胶质瘤患者瘤周神经元表面KCC2表达减少，NKCC1表达增加，伴有去极化甚至兴奋性GABA反应；神经元表面KCC2表达减少，可以建立GABAAR介导的抑制所需的低Cl-，控制神经元和胶质瘤细胞中的Cl-，故KCC2可以作为致痫性胶质瘤治疗靶点[35-36]。

癫痫发作前，致痫海马区谷氨酸浓度较高，而GABA浓度较低。在癫痫发作期间，致痫海马内的细胞外谷氨酸浓度持续增加，达到潜在的神经毒性浓度。细胞外谷氨酸的升高可能加速癫痫发作，浓度升高可能导致细胞死亡[37]。同谷氨酸一样，在癫痫发作期间，脑内BDNF水平增加[38]。BDNF不仅是KCC2的调节因子，也是脊髓兴奋性的有效调节因子。SCI后，KCC2表达的活性依赖性增加，有助于减少过度反射，这种增加由BDNF调节。BDNF下调KCC2的机制尚不清楚，但TrkB作用已被确定，了解TrkB损害KCC2功能的机制可能有助于确定治疗颞叶癫痫的潜在药物靶点。新生儿癫痫发生率为3.5‰，缺氧缺血性脑病占50%～60%，其中半数对苯巴比妥等一线抗癫痫药物耐药。缺血损伤后TrkB的激活可通过下调KCC2来增加神经元的兴奋性。有研究采用单侧颈动脉结扎诱导新生小鼠缺血后，在P7和P10 CD1小鼠中使用了三种不同剂量的TrkB拮抗剂——ANA12。P7 CD1小鼠中，ANA12以剂量依赖的方式显著地挽救了苯巴比妥耐药癫痫，并在P10 CD1小鼠中提高了苯巴比妥的疗效。与雄性相比，雌性幼犬对低剂量ANA12的反应更好。当单独使用苯巴比妥无效时，ANA12可显著逆转缺血后KCC2的下调和P7处TrkB通路的激活。挽救KCC2功能低下可能是预防难治性癫痫出现的关键[39]。KCC2代谢紊乱和Cl-功能失调与癫痫发病风险增加相关的疾病相关，如唐氏综合征、脆性X染色体综合征、Rett综合征(RTT)[40-42]。RTT是一种由甲基CpG结合蛋白2(MECP2)基因突变引起的神经发育障碍。人类RTT神经元和RTT小鼠模型KCC2表达降低[42-43]，提示KCC2可能参与了RTT的病理生理过程。有研究发现一组增强KCC2表达的化合物，即KCC2表达增强化合物，包括Fms样酪氨酸激酶的抑制剂3、糖原合成酶激酶3β、Sirtuin蛋白1激动剂和瞬时受体电位阳离子通道亚V成员1[44]。苗头化合物处理后，人野生型和同基因MECP2突变，RTT神经元中KCC2表达增加，RTT神经元电生理和形态异常得以恢复。在MECP2突变小鼠体内注射KCC2表达增强化合物KW-2449或Piperine可改善疾病相关的呼吸和运动表型。该小分子化合物可能不仅在RTT中有治疗作用，而且在涉及KCC2失调的其他神经疾病中也有治疗作用[44]。

3 总结与展望

KCC2功能与多种神经系统疾病有关，包括SCI痉挛、神经性疼痛和癫痫等。在神经系统相关疾病的治疗过程中，通过调控KCC2表达可以减轻相关疾病症状，同时KCC2也可以作为相关药物的作用靶点在神经系统疾病治疗中发挥作用。在体KCC2表达的调控和KCC2靶向药物的应用会对未来神经系统相关疾病的治疗起到重要作用。