帕金森病模型小鼠脾悬液中辅助性T细胞17和髓系抑制性细胞数量的变化及其意义

陈思远，舒扬，赵峰，于明

·论著·

帕金森病模型小鼠脾悬液中辅助性T细胞17和髓系抑制性细胞数量的变化及其意义

陈思远，舒扬，赵峰，于明

目的探讨帕金森病(PD)模型小鼠脾悬液中辅助性T细胞17(Th17)和髓系抑制性细胞(MDSC)数量的变化及其意义。方法将40只C57BL/6小鼠随机分为PD组(A组)、PD+吉西他滨组(B组)、吉西他滨组(C组)与对照组(D组)，每组10只小鼠。A组和B组予1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶 (MPTP)(30 mg/kg)连续腹腔注射7 d；B组和C组于第1 d，7 d腹腔注射吉西他滨(120 mg/kg)；D组予等体积生理盐水腹腔注射。第8 d进行行为学实验后，检测各组小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞数量和脾悬液Th17和MDSC细胞百分率。结果与建模前比较，A组、B组小鼠调头时间、爬杆时间明显延长，悬挂时间明显缩短(均P<0.05)。与C组、D组比较，建模后A组、B组小鼠调头时间、爬杆时间明显延长，悬挂时间明显缩短(均P<0.05)。A组、B组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数量较C组和D组明显减少(均P<0.05)。A组、B组小鼠脾悬液中Th17、MDSC细胞百分数较C组和D组明显升高(均P<0.05)；且B组小鼠脾悬液中Th17细胞百分数明显高于A组(P<0.05)，A组小鼠脾悬液中MDSC细胞百分数明显高于B组(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示，A组和B组小鼠Th17和MDSC细胞百分数间均无相关性(r=-0.319，r=0.04，均P>0.05)。结论PD模型小鼠Th17、MDSC数量增加，可能参与了PD的发生发展。MDSC有可能发挥了抑制Th17扩增的免疫调节作用。

帕金森病;辅助性T细胞17;髓系抑制性细胞;1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶;吉西他滨

帕金森病(PD)是常见的进展性神经系统变性疾病，主要病理改变为黑质多巴胺能神经元变性死亡，纹状体内多巴胺供应不足，进而引起静止性震颤、肌强直、运动迟缓、姿势步态异常等症状[1]。神经免疫炎性机制参与了PD的发生发展，主要表现为脑内小胶质细胞过度激活介导神经炎症反应，进而诱发并加重PD的病理过程[2]。辅助性T细胞17(Th17)、髓系抑制性细胞(MDSC)在部分炎性疾病发生发展过程中发挥重要作用[3]，但其对PD作用如何尚未确定。吉西他滨作为可影响核酸生物合成的药物，常用于肿瘤等疾病治疗。由于其有选择性消除MDSC的特点，且尚未发现对神经系统的影响[4]，现普遍用于MDSC与神经系统疾病关系的研究中[5]。本研究通过1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)建立PD小鼠模型，检测其脾悬液中Th17和MDSC的细胞百分率。并通过吉西他滨干预MDSC，初步探究Th17和MDSC在PD中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物及分组 SPF级健康雄性6～8周龄C57BL/6小鼠40只，购买并饲养于江苏大学动物实验中心，许可证：SCXK(苏)2013-0011，分笼饲养，自由摄食、饮水，昼夜循环光照。适应环境1周后，随机平均分为PD组(A组)、PD+吉西他滨组(B组)、吉西他滨组(C组)与对照组(D组)。

1.1.2 药品和试剂 盐酸吉西他滨(泽菲)购于江苏豪森药业，批准文号：国药准字H20030104。红细胞裂解液、DAB显色试剂盒、RPMI-1640培养基和HRP-羊抗兔购于碧云天公司。MPTP、Th17刺激剂(50 ng/ml PMA、1 μg/ml 离子霉素和1 μg/ml 莫能霉素)、Fix&Perm液、CD3-APC、CD8-FITC、IL-17A-PE、CD11b-PE、Gr-1-FITC及相关同型对照抗体均购于美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 各组小鼠处理方法 各组小鼠于建模前1 d予行为学试验排除有明显个体差异的小鼠。A组和B组小鼠予MPTP(30 mg/kg)连续腹腔注射7 d建立亚急性PD模型；B组和C组小鼠于第1 d、7 d予腹腔注射吉西他滨(120 mg/kg)；D组小鼠予等体积生理盐水腹腔注射。第8 d进行行为学试验后，二氧化碳麻醉处死小鼠，酒精中浸泡5 min，取小鼠脾脏，脑组织留待相关细胞因子检测和酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色。

1.2.2 行为学试验

1.2.2.1 爬杆试验 将长30 cm木杆竖立固定，并用直径5 cm的泡沫板固定于木杆顶部。试验时将小鼠头朝上放置于木杆顶端，分别记录小鼠调转方向头朝下和小鼠爬至杆底的时间。每只小鼠检测3次，每次间隔2 min。

1.2.2.2 悬挂试验 透明有机玻璃制作悬挂试验箱，水平放置一根直径0.5 cm，距离地面30 cm的木杆，木杆上约0.8 cm加盖。试验中将小鼠悬挂于木杆，记录小鼠落地时间，若超过3 min仍未落地，则记为180 s。每只小鼠检测3次，每次间隔2 min。

1.2.3 免疫组化检测小鼠中脑黑质区的TH阳性细胞 小鼠脑组织固定于4%甲醛溶液，常规石蜡包埋切片，脱蜡至水后高压抗原修复，PBS清洗后依次分别予0.25%Triton-X100、3%H2O2浸泡10 min，2.5%牛血清白蛋白室温封闭1 h后加入TH抗体稀释液(1∶100)，4 ℃过夜后加入二抗，室温孵育1 h，滴加DAB显色液， Nikon ECLIPSE Ti 显微镜(×40)下拍摄每张切片中脑右侧黑质区，采用Image J软件处理后，每张切片取400 μm × 400 μm视野的五个不同区域，计平均TH阳性细胞数。

1.2.4 脾悬液制备 取小鼠脾脏置入300目筛网研磨、过滤，收集细胞悬液入EP管，4 ℃，500 g离心5 min。弃上清，红细胞裂解液处理后，收集细胞并加RPMI-1640培养基制成细胞数约为2×106/ml的脾细胞悬液备用。

1.2.5 Th17数量的检测 流式管内加入100 μl上述脾悬液和1 μl Th17刺激剂，在37 ℃、5%CO2环境下孵育5 h后加入5 μl CD3-APC和2 μl CD8-FITC。避光孵育后均分两管，Fix&Perm 液破膜、固定后，样本管内加入5 μl IL-17A-PE，与同型对照管避光孵育后，利用FACS Calibur流式细胞仪检测Th17细胞百分数，选取CD3+标记的细胞群，随后选取IL-17+CD8-细胞作为Th17。

1.2.6 MDSC数量的检测 流式管内加入上述脾悬液50 μl，并加5 μl CD11b-PE，2 μl Gr-1-FITC，同型对照管内加入等量脾悬液和对应同型对照抗体，避光孵育后利用FACS Calibur流式细胞仪检测MDSC细胞百分数。选取CD11b+Gr-1+细胞作为MDSC。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般运动行为观察 建模前各组小鼠运动方面均无明显差异。建模结束后A组和B组小鼠出现震颤、运动减少、步态不稳、竖尾竖毛等表现，C组和D组较建模前无明显异常。

2.2 各组间行为学试验结果的比较 见表1。建模前，各组小鼠行为学试验中均未见表现明显异常的小鼠，各组间行为学试验结果比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。与建模前比较，A组、B组小鼠调头时间、爬杆时间明显延长，悬挂时间明显缩短(均P<0.05)。与C组、D组比较，建模后A组、B组小鼠调头时间、爬杆时间明显延长，悬挂时间明显缩短(均P<0.05)。

2.3 各组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数的比较 见图1、表2。C组和D组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞丰富， A组和B组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数较C组和D组明显减少(均P<0.05)。

表1 各组小鼠行为学试验结果的比较(x±s,s,n=10)组别建模前调头时间爬杆时间悬挂时间建模后调头时间爬杆时间悬挂时间A组0.87±0.162.51±0.28171.40±9.721.35±0.41*△▲4.78±0.87*△▲134.40±22.23*△▲B组0.89±0.122.55±0.33173.50±6.111.25±0.34*△▲4.96±0.80*△▲132.80±25.94*△▲C组0.84±0.152.57±0.41172.60±7.900.82±0.182.58±0.45171.70±9.23D组0.89±0.182.60±0.42172.50±6.330.88±0.202.64±0.48169.90±14.26 注:与建模前比较*P<0.05;与D组比较△P<0.05;与C组比较▲P<0.05

图1 小鼠中脑黑质区TH阳性细胞染色呈黄褐色，方框内为小鼠中脑黑质区。A组(A)和B组(B)小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数较C组(C)和D组(D)明显减少(免疫组化染色，×40)

表2 各组小鼠中脑黑质区TH阳性细胞数和脾悬液中Th17与MDSC细胞百分数(x±s,n=10)组别TH阳性细胞数(个)Th17细胞百分数(%)MDSC细胞百分数(%)A组 5.87±2.01*△ 0.54±0.07*△▲ 11.17±0.68*△▲B组5.39±2.63*△1.35±0.09*△4.66±0.35*△C组11.27±1.870.26±0.072.71±0.26D组10.16±2.300.28±0.062.40±0.28 注:与D组比较*P<0.05;与C组比较△P<0.05;与B组比较▲P<0.05

2.4 各组小鼠Th17细胞百分数的比较 见表2。A组、B组小鼠脾悬液中Th17细胞百分数较C组和D组明显升高(均P<0.05)；且B组小鼠脾悬液中Th17细胞百分数较A组明显升高(P<0.05)。

2.5 各组小鼠MDSC细胞百分数的比较 见表2。A组、B组小鼠脾悬液中MDSC细胞百分数较C组和D组明显升高(均P<0.05)；且A组小鼠脾悬液中MDSC细胞百分数较B组明显升高(P<0.05)。

2.6 A组和B组小鼠Th17和MDSC细胞百分数相关性 Pearson相关性分析结果显示，A组和B组小鼠Th17和MDSC细胞百分数间均无相关性(r=-0.319，r=0.04，均P>0.05)。

3 讨 论

近年研究[6]认为，CNS小胶质细胞和星形胶质细胞过度激活后，释放多种炎性细胞因子(如IFN-γ、IL-6、IL-1β等)介导脑实质内的免疫炎性反应，引起多巴胺能神经元死亡，从而诱发和加重PD的病理过程。除了小胶质细胞激活，PD患者和小鼠黑质区域均存在CD4+T淋巴细胞浸润，说明免疫细胞如T淋巴细胞在PD进程中也参与介导了神经免疫炎性反应[7-8]。由于血-脑屏障的存在，外周免疫细胞无法通过并进入脑实质中。而在PD中，血-脑屏障功能受损，T淋巴细胞可在趋化因子作用下通过受损的血-脑屏障，进入CNS发挥免疫应答作用[2]。有研究[9]报道，Th17在CD4+T细胞参与的PD免疫炎症反应中起着关键作用，可通过释放IL-17，激活小胶质细胞释放TNF-α、IL-1等炎性因子，导致多巴胺能神经元受损，进而引起PD症状。MDSC是一群重要的免疫调节细胞，在许多病理条件下被认为是免疫网络中干扰T细胞应答的重要组成部分[10]。

在人体中，初始CD4+T细胞的分化可能会受CD14+HLA-DR+单核细胞和CD14+HLA-DR-MDSC的影响，前者可诱导Th17的分化，通过释放炎性因子促进免疫炎性反应，后者可诱导调节性T细胞扩增，并通过IL-10、转化生长因子-β的释放抑制Th17介导的多巴胺能神经元免疫损伤，进而对免疫炎性反应负调控[11]。有研究[12]表明，在系统性红斑狼疮的病理过程中，MDSC自身亦可通过产生精氨酸酶-1来促使Th17扩增。这提示在不同环境下，MDSC可通过对Th17及相关细胞因子的调节，影响机体免疫炎性反应[11]。本研究通过MPTP建立PD模型，行为学试验和小鼠中脑黑质区TH阳性细胞检测对PD小鼠进行验证，检测小鼠脾悬液中Th17和MDSC细胞百分数，初步探究Th17与MDSC在PD进程中的机制。结果显示，Th17细胞百分数和MDSC细胞百分数在PD中有不同程度的升高，在吉西他滨对MDSC进行干预后，Th17细胞百分数进一步升高，提示在MPTP建立的PD模型中，二者共同参与了PD的发生发展，且在PD免疫炎性反应进程中，MDSC可能发挥其免疫调节作用抑制Th17扩增。但Th17与MDSC在PD中如何相互影响，对二者免疫炎性反应调节机制仍需进一步探索。同时限于本研究样本数量少，尚未证明PD中MDSC与Th17之间的相关性。本研究通过初步探讨Th17和MDSC在PD中的可能作用，拓宽了PD机制研究的视野，为延缓PD进程及治疗提供了新的研究方向和依据。

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ChangesandtheirsignificancesofthenumbersofThelper17cellsandMyeloid-derivedsuppressorcellsinthespleensuspensionofmodelmousewithParkinson’sdisease

CHENSi-yuan,SHUYang,ZHAOFeng,etal.

DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China

ObjectiveTo observe the changes and their significances of the numbers of T helper 17 cells (Th17) and Myeloid-derived suppressor cells (MDSC) in the spleen suspension of model mouse with Parkinson’s disease (PD).MethodsForty C57BL/6 mouse were randomly divided into PD group (A group), PD+Gemcitabine group (B group), Gemcitabine group (C group) and control group (D group), with 10 mouse in each group. Mouse in group A and B were injected intraperitoneally with 1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) (30 mg/kg) for 7 d continuously. Mouse in group B and C were injected intraperitoneally with Gemcitabine (120 mg/kg) at 1 d and 7 d. After behavioral experiment at 8 d, the number of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells in the substantia nigra and the cell percentage of Th17 and MDSC in the spleen suspension of mouse in each group were detected.ResultsCompared with before modeling, the turning around time and pole climbing time of mouse in A group and B group after modeling were significantly longer, while the suspension time was significantly shortened (allP<0.05). Compared with C group and D group, the turning around time and pole climbing time of mouse in A group and B group after modeling were significantly longer, while the suspension time was significantly shortened (allP<0.05). Compared with C group and D group, the numbers of TH positive cells in substantia nigra of mouse in A group and B group were significantly reduced (allP<0.05). Compared with C group and D group, the cell percentages of Th17 and MDSC in the spleen suspension of mouse in A group and B group were significantly increased (allP<0.05). The cell percentage of Th17 in the spleen suspension of mouse in B group was significantly higher than A group (P<0.05), while the cell percentage of MDSC in the spleen suspension of mouse in A group was significantly higher than B group (P<0.05). Pearson correlation analysis results showed that there was no correlation between the cell percentages of Th17 and MDSC in A group and B group (r=-0.319,r=0.04, allP>0.05).ConclusionsTh17 and MDSC are increased in PD model mice. They may be involved in the occurrence and development of PD. MDSC maybe plays an immune role in inhibition of Th17 amplification.

Parkinson’s disease; T helper 17 cells; Myeloid-derived suppressor cells; 1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine; Gemcitabine

R742.5

A

1004-1648(2017)05-0369-04

江苏省自然科学基金(BK20160548)；江苏省“333工程”科研项目(BRA2014173)；江苏省“六大人才高峰”科研项目(WSN038)；镇江市重点研发计划(SH2016032)；镇江市社会发展科技计划项目(SH2015047)

212001 镇江，江苏大学附属医院神经内科[陈思远(在读硕士研究生)，赵峰，于明]，中心实验室(舒扬)

于明

2017-02-03

2017-04-20)