肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤的影响

韦江莲，陈雪丽，兰 岚，韦 稳，蒙 娜，黄盛凯，黄彦峰

（右江民族医学院，广西 百色 533000）

蕨类植物资源丰富，民间用药历史悠久。肾蕨系骨碎补科肾蕨属植物 Nephrolepi scordifolia（L.）Presl，别名马骝卵、凤凰蛋、石黄皮、圆羊齿等，是一种具有壮族特色的药用植物［1］。肾蕨用药部位为全株或块茎，具有祛湿消肿、清热解毒功效，临床用于治疗黄疸、淋浊、小便涩痛、痢疾、疝气、乳痈、瘰疬、烫伤、刀伤等病症［2］。民间常用肾蕨全株煎水治疗湿热黄疸，疗效良好。近年来，国内对肾蕨化学成分、提取工艺、药理作用以及质量标准的研究已取得一定进展［3-11］。为进一步探究肾蕨对肝脏的保护作用，本实验采用酒精灌胃的方式造成小鼠急性酒精肝损伤模型，观察肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤的影响并探讨其可能的作用机制，为研究肾蕨的护肝作用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物 健康昆明种小鼠50只，雌雄各半，体质量18～22 g，由右江民族医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK桂2017-0003。

1.2 仪器 TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）；PRO200型匀浆机（PROScientific Inc Oxford CT，USA）；7600service日立自动生化分析仪（日本日立集团）；722 N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.3 药品及试剂 肾蕨采自百色市东坪水库，经鉴定为骨碎补科肾蕨属植物 Nephrolepi scordifolia（L.）Presl；联苯双酯滴丸（北京协和药厂，批号：15100102）；考马斯亮蓝试剂、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、总超氧化物歧化酶（SOD）试剂，均购自南京建成生物研究所；56°牛栏山二锅头（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂）。

2 方法

2.1 肾蕨水提液的制备［3］将新鲜肾蕨全株烘干粉碎，称取粗粉10 g，置锥形瓶中，加入蒸馏水100 ml，冷浸24 h，取滤液浓缩至10 ml，即含生药量1 g/ml，冷藏，用时恢复至室温。

2.2 动物分组及给药 取健康昆明种小鼠50只，雌雄各25只，随机将小鼠分为5组：空白组、模型组、联苯双酯滴丸组（0.10 g/kg）、肾蕨水提液低剂量组（3.25 g/kg）及肾蕨水提液高剂量组（6.50 g/kg）。每组10只。联苯双酯滴丸组和肾蕨水提液高、低剂量组分别按每天10ml/kg给药，空白组和模型组每日给予等量生理盐水，连续给药14d，最后一次给药1h后除空白组给予等量的生理盐水外，其余各组小鼠均按15 ml/kg给予56°牛栏山二锅头灌胃造模［12］，禁食不禁水 16h。

2.3 指标测定

2.3.1 血清ALT、AST的测定 造模16 h后称量小鼠体重，眼球取血，静置2 h后，3 500 r/min离心10 min，取上层血清备用［11］。通过自动生化分析仪检测小鼠血清 ALT、AST。

2.3.2 小鼠肝脏指数测定 将采血后的小鼠立即处死，同时迅速取出肝脏，并置入冰冻的0.9%氯化钠溶液中清洗，滤纸吸干表面水分，观察小鼠脏器外观，称肝湿重，并计算肝脏指数，其中肝脏指数＝1000×［肝脏湿重/体重］×100%。

2.3.3 肝组织中MDA、GSH、SOD的测定 取小鼠同一部位肝脏左叶，按照1∶9的比例，放入冰冻的生理盐水中，剪碎后匀浆，制备成10%肝组织匀浆。将10%肝组织匀浆置于离心机，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液留置备用。按照试剂盒说明书进行严格操作，通过考马斯亮蓝法测定小鼠肝组织蛋白质浓度，测定肝组织MDA、GSH、SOD吸光度值，通过试剂盒所提供的公式计算肝组织中MDA、GSH、SOD的含量。

2.3.4 肝脏病理组织学检查 另取小鼠右叶相同部位肝组织置于10%福尔马林溶液中保存，组织切片，HE染色，在光镜下观察肝脏病理组织学变化以及图片采集。

2.4 统计学分析 使用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤肝指数的影响 见表1。

表1结果显示，与空白组比较，模型组肝指数明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，联苯双酯滴丸组及肾蕨水提液低、高剂量组肝指数均显著降低（P＜0.01）。

表1 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤肝指数的影响（x±s）

3.2 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤血清ALT、AST的影响 见表2。

表2结果显示，与空白组比较，模型组血清ALT、AST 含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，联苯双酯滴丸组及肾蕨水提液低、高剂量组的ALT、AST含量均显著降低（P＜0.01）。

3.3 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤肝组织MDA、GSH、SOD的影响 见表3。

表3结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肝组织中MDA含量显著升高（P＜0.01），GSH水平和SOD活性降低（P＜0.05）；与模型组比较，联苯双酯滴丸组及肾蕨水提液低、高剂量组MDA含量显著降低（P＜0.01），SOD 活性及 GSH 水平显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。

表2 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤血清ALT、AST的影响 （±s）

表2 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤血清ALT、AST的影响 （±s）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01

组 别 n 剂量（g/kg） ALT（U/L） AST（U/L）空白组 10 — 46.00±6.91 115.70±18.54模型组 10 — 118.70±11.14① 206.70±27.16①联苯双酯滴丸组 10 0.10 55.10±13.04② 25.30±15.70②肾蕨水提液低剂量组 10 3.25 63.00±9.13② 167.78±18.81②肾蕨水提液高剂量组 10 6.50 57.90±11.16② 150.60±18.68②

表3 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤肝组织MDA、GSH、SOD的影响 （±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比较，③P＜0.05，④P＜0.01

组 别 n 剂量（g/kg） MDA（nmol/ml） GSH（U/ml） SOD（U/ml）空白组 10 — 7.28±1.98 25.01±2.77 228.53±21.99模型组 10 — 24.09±3.55② 19.69±2.35① 206.52±27.69①联苯双酯滴丸组 10 0.10 12.54±3.73④ 23.33±2.22④ 228.62±29.03③肾蕨水提液低剂量组 10 3.25 15.27±4.07④ 22.65±2.36③ 235.79±20.96④肾蕨水提液高剂量组 10 6.50 14.79±6.37④ 22.65±3.11③ 230.98±19.86③

3.4 肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤肝脏病理组织学的影响 肝组织常规HE染色镜下可见：空白组小鼠肝细胞组织结构正常，轻微水肿，汇管区有少量炎症细胞浸润，无明显病理变化；模型组小鼠肝细胞组织结构有显著的病理变化，肝组织结构弥漫性水肿，胞浆肿胀透亮、疏松，有大量炎症细胞浸润，肝细胞明显溶解、坏死；联苯双酯滴丸组肝细胞组织有水肿，受炎症细胞浸润，有部分肝细胞再生表现；肾蕨水提液低剂量组肝细胞组织有水肿，少量炎症细胞浸润，有肝细胞再生表现；肾蕨水提液高剂量组肝细胞组织结构水肿减轻，极少炎症细胞浸润，肝细胞再生表现明显。见图1。

图1 各组小鼠肝脏组织显微结构（HE，×200）

4 讨论

过量饮用乙醇会导致肝组织损伤，通常认为与抗氧化损伤、脂质过氧化损伤及免疫损伤等有关［13］。过量的乙醇在机体内代谢可产生大量的自由基，致使抗氧化能力降低，导致肝细胞严重损伤。此外，机体的免疫功能与其免疫器官重量改变密切相关，在机体中，肝脏内含有吞噬功能强大的免疫细胞，具有防御免疫能力［14］。由此，本研究将肝脏指数变化作为观察指标之一。实验结果表明，与模型组比较，肾蕨水提液低、高剂量组肝指数均显著降低，表明肾蕨水提液可降低急性酒精肝损伤小鼠的肝指数，对受损肝脏具有一定的保护作用。在正常的肝脏中，ALT、AST转氨酶对于肝脏代谢极其重要，是反映肝功能的敏感指标。当肝组织损伤时，细胞的胞浆及线粒体分别将ALT、AST释放入血中，造成ALT、AST在血清中的含量有不同程度的升高［15］。与模型组对比，肾蕨水提液低、高剂量组ALT、AST含量明显降低，说明肾蕨水提液能抑制急性酒精肝损伤小鼠的转氨酶升高。MDA是肝细胞中发生脂质过氧化反应的终产物，侧面反映出肝细胞损伤的程度［16］。在正常的机体中存在着抗氧化酶和抗氧化剂，形成了重要的防御系统以对抗活性氧产生的损害。GSH是一种衡量机体抗氧化能力大小的低分子清除剂［16］。在机体受到外界因素影响时，SOD保护细胞避免受到破坏及清除超氧阴离子自由基，对维持机体的氧化和抗氧化平衡起关键作用。与模型组对比，联苯双酯滴丸组及肾蕨水提液低、高剂量组MDA含量降低，SOD活性和GSH水平升高，说明肾蕨水提液可以减少抗脂质过氧化和提高抗氧化酶的活性，有效清除活性氧自由基，进而对损伤的肝细胞起到保护作用。此外，各组小鼠肝组织病理学检查结果显示，模型组小鼠肝组织结构弥漫性水肿，胞浆肿胀透亮、疏松，有大量炎症细胞浸润，肝细胞明显溶解、坏死。而经过肾蕨水提液干预后的小鼠，其肝细胞组织结构水肿减轻，少量炎症细胞浸润，有肝细胞再生表现，表明对急性酒精肝损伤具有一定的保护作用。

综上所述，肾蕨水提液对小鼠急性酒精肝损伤有保护作用，其机制可能与抗脂质过氧化、清除超氧阴离子自由基、抑制肝脏炎症反应有关。由于肾蕨水提液所含成分较为复杂，具体作用机制有待进一步探究。