金槐ISSR-PCR反应体系的优化研究

傅 鹏，陈恒宇，谢 锋，笪舫芳，王孝勋，高 洁，曾锦燕

（广西中医药大学，广西 南宁 530001）

槐花为豆科植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，前者习称“槐花”，后者习称“槐米”。金槐Sophora japonica cv.Jinhuai是从槐树中选育出的优良栽培品种；因其槐米颜色金黄，故名为金槐［1］。槐米中富含芦丁、槲皮素、桑色素等黄酮类物质［2］，其芦丁的含量较高，在医药工业中常以槐米为原料提取芦丁［3］，芦丁也是其有效成分和指标成分［4］。现有研究表明，芦丁和槲皮素具有广泛的药理活性［5］，尤其在心脑血管疾病治疗中发挥着独特的功效［6］。开展金槐的种质资源研究，了解金槐遗传变异水平和基因组进化分类体系，探寻遗传多样性和金槐品种的相关性，挖掘金槐的优良品种，并指导金槐的良种选育、品种鉴定，对于金槐产业经济的发展具有重要意义。为此，需要建立一套有效、快速、稳定的鉴定体系为金槐质量提供保障。

ISSR（inter simplesequencerepeat）分子标记是以植物中广泛存在的微卫星序列为基础，开发出以简单重复序列为单引物进行多位点PCR扩增的检测技术。该标记的首要特点就是引物设计无需预知分析物种的基因组序列，能够直接扩增2个序列相同但方向相反的反向重复序列之间的DNA片段。ISSR技术具有操作简单，且同时综合了其他分子标记多态性好、可重复性、低成本以及无需知道基因组序列等优点［7］。由于植物基因组中微卫星广泛分布，且等位变异特别丰富，采用ISSR扩增条带多态性较丰富，因此被认为是一种理想的遗传标记。目前广泛用于植物研究，可对植物进行基因定位［8］、指纹图谱［9］、品种鉴定［10］及遗传多样性［11］等研究。

目前，唐健民等［12］对金槐的ISSR-PCR反应体系进行了相关的研究，并就Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、Taq酶的浓度建立了金槐ISSR-PCR反应体系。而且也有较多相关研究就上述五种因素建立了多种植物的ISSR-PCR反应体系［13-15］。但是随着科学技术的发展，发现传统的ISSR-PCR体系由于操作繁琐等原因，产生的误差较大，并不能达到很高的重复性和快速鉴定的效果。PCRMaster MIX是目前市面上很常见的一种常规PCR预混合液，含有Taq DNA Polymerase、dNTP混合物、MgCl2以及优化的缓冲体系。反应时需要加入引物和模板即可进行扩增，能够大大简化实验的操作步骤，减少实验操作误差，增强扩增效果，提高实验的重复性。本实验采用上海翊圣生物科技有限公司的2×HieffTMPCRMaster MIX对金槐的ISSR-PCR反应体系进行探索，以期为金槐品种建立一种分子标记技术快速鉴定的技术。现报道如下。

1 实验材料

1.1 供试品 金槐ISSR分子材料取自广西临桂地区的金槐嫩叶，采摘后用硅胶干燥保存并带回室内，于-20℃冰箱中保存。

1.2 主要仪器 PCR仪（BIO-RADT100 Thermal Cycler）；DDY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；BIO-RAD凝胶成像仪（BIO-RAD GelDoc XR+）；Merck Millipore Direct-Q 3，5，8纯水／超纯水一体机（德国默克集团）；H1650-W型离心机（湘仪）；MLS-3781L-PC型灭菌锅（日本松下）；超微量分光光度计（北京天根）；TGemspectrophotometer Plus、移液枪等。

1.3 试剂 2×HieffTMPCR Master MIX（上海翊圣生物科技有限公司）；无菌无酶水［生工生物工程（上海）股份有限公司］；10×PCR buffer、Mg2+、dNTP、TaqDNA 聚合酶、模板 DNA、DNA Marker、ISSR-PCR 引物（华大基因）、EB液、琼脂糖等。

2 方法

2.1 DNA提取与检测 采用改进的CTAB方法［16］进行金槐DNA的提取，并于超微量分光光度计检测DNA浓度，最后置于-20℃冰箱保存。

2.2 ISSR-PCR反应体系的对比 参考ISSR引物的设计，选用哥伦比亚大学（Universityof British Columbia，UBC）公布的序列。本文选用的两套引物分别是UBC840［（GA）8YT］和 UBC843［（CT）8RA］。分别设计两组：组别1采用传统扩增体系和上述两套引物对金槐DNA进行扩增，组别2将使用PCRMaster MIX（常规PCR预混合液）和上述两套引物对金槐DNA进行扩增。组别1将参考同种植物金槐的PCR反应体系，在 25 μl反应体系中含有：10×PCRbuffer 2.5 μl，MgCl22.5 mmol/L，ISSR 引物 0.6 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，Taq酶 1.0 U，模板 DNA 约 50 ng；组别 2 参考 2×HieffTMPCRMaster MIX说明书的反应体系，在25μl的体系中含有：2×HieffTMPCR Master MIX 12.5 μl，ISSR 引物0.6μmol/L，模板DNA约50 ng。扩增程序参考唐健民等［12］和 2×HieffTMPCRMaster MIX 说明书：94℃预变性5 min，然后进行94℃变性30 s，退火45 s（退火温度根据引物Tm值在PCR仪上进行40℃～60℃之间的梯度设置，PCR仪将形成8个温度梯度，即：40℃、41.3℃、43.7℃、47.6 ℃、52.2 ℃、55.8 ℃、58.4 ℃、60.0 ℃），35 个循环，72℃延伸7 min，最后于4℃保存。取经上样缓冲液染色后的扩增产物10μl，在2%琼脂糖凝胶和0.5×缓冲电泳液中电泳，电泳条件设置为：恒压155 V电泳30～40 min，即染色带移动至约琼脂糖凝胶的2/3位置处，然后将电泳后的琼脂糖凝胶放置于EB液（0.5 μg/ml）中染色 10 min，最后放置于 BIO-RAD 凝胶成像系统中拍照。

3 结 果

3.1 金槐DNA样品的质量检测 用天根超微量分光光度计分析所提样本DNA浓度和质量。核酸浓度在160～220 ng/μl之间，DNA 在 260 nm 和 280 nm 波长下的吸光度比值（OD260/OD280）在 1.70～1.90 之间，说明DNA纯度较高，蛋白和RNA的污染都比较少。所以，样本所提取的DNA质量和浓度符合要求，可以进行后续试验。

3.2 ISSR-PCR反应体系的对比与直观分析 在BIO-RAD凝胶成像仪下观察不同引物分别在两个ISSR-PCR体系中的扩增条带，见图1，图2。对比图1和图2可以明显看到，组别2的条带清晰，条带数明显比组别1多。可以看出PCRMaster MIX的扩增效果明显比传统扩增体系好。

4 讨论

PCR反应体系按照以往的研究方式一般都会对Mg2+、引物、dNTPs、DNA模板和Taq酶的浓度进行探索，得出最佳的ISSR-PCR反应体系，但根据实验研究发现，按以往的方法摸索得到的ISSR-PCR反应体系操作较繁琐，反复冻融也容易导致试剂失活，容易产生较大的实验误差，最终导致实验的重复性下降，难以达到鉴别的效果。而采用PCRMaster MIX进行金槐DNA-PCR扩增，所得效果明显，条带清晰，条带数目多，一是因为PCR Master MIX是即用型的常规PCR预混合溶液，减少了试剂的多次冻融导致失活；二是加入了稳定剂，增加了试剂的稳定性，提高了扩增的效果。本研究对比了引物UBC840和引物UBC843分别在不同体系的扩增效果，采用了梯度温度进行扩增，结果对比性强，结果清晰，各个温度都能明显看到PCRMaster MIX的扩增效果更好。ISSR分子标记在鉴定领域中应用广泛，而PCR扩增正是ISSR分子标记必不可少的步骤，快速稳定的扩增效果将直接提高分子鉴定的稳定性和可靠性。PCRMaster MIX的扩增效果稳定、效率高，使分析结果更加科学可靠，更具说服力，可为今后的分子鉴定提供一个更好的选择。

图1 组别1采用传统扩增体系扩增金槐DNA

图2 组别2使用PCR Master MIX扩增金槐DNA