基于系统药理学研究香附治疗原发性痛经的作用机制

程边媛，陶 峰，郭子湖，陈红波

（1.安徽医科大学附属妇幼保健院，安徽 合肥 230001；2.西北农林科技大学生命学院生物信息学中心系统药理学实验室，陕西 咸阳 712100）

原发性痛经是最常见的妇科疾病，以月经前后出现不规则下腹痛或痉挛为特征，不伴盆腔器质性病变，严重者有恶心、呕吐、腹泻等伴随症状，严重影响现代女性的学习和生活［1］。原发性痛经的病理机制尚不完全清楚，目前认为前列腺素的异常增加是重要的致病因素，导致子宫异常收缩，减少子宫血流量，引起周围神经的敏感性从而引起疼痛［2］。非甾体抗炎药（NSAID）是治疗原发性痛经的一线药物，主要通过抑制环氧酶，减少前列腺素的合成，达到抗炎止痛的目的，但长期服用会产生胃肠道等不良反应［3］。中药香附具有解郁引气、调经止痛的功效，对原发性痛经治疗效果显著，副作用少，现代药理研究发现香附有抑制平滑肌收缩、阻止痛觉信号传导和雌激素样作用［4］。由于香附所含成分复杂，作用机制繁多，探究其治疗原发性痛经的作用机制成为药理学研究的难点。随着信息化的发展，系统药理学作为一门新学科逐渐兴起，通过整合计算机技术、生物信息学、网络药理学等多门学科，已初步应用于中药复方作用机制的研究中，如合理地解释了犀角地黄汤、藏红花复方治疗病毒性出血热和心血管疾病的作用机制［5-6］。本研究通过系统药理学方法探索香附在原发性痛经治疗中的药效物质和作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 利用分析软件和数据库进行系统药理实验研究，主要包括系统药理学数据库（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php） 、Uniprot 数 据 库（http：//www.uniprot.org） 、DAVID 数 据 库（http：//david.abcc.ncifcrf.gov）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路数据库（http//www.kegg.jp/）、中国知网、万方数据库、药物—靶点相互作用（Chemistry-Genomics-Pharmacology Integration，CGPI） 模型、WES 模型、Cytoscape3.3.0 软件、Visio绘图软件。

1.2 筛选香附的活性成分和作用靶点

1.2.1 药物分子筛选 结合文献报道和系统药理学数据库（TCMSP）来收集香附含有的所有成分，通过药物动力学ADME相关参数如口服生物利用度（OB）、Caco-2透过性、血脑屏障（BBB）和类药性（DL）筛选出候选的活性分子［7］。根据TCMSP建议的筛选标准如下：OB≥30%、Caco-2＞0、BBB＞-0.3、DL≥0.18；同时从中国知网、万方数据库搜索与香附成分相关的研究文献，对入选的成分进行补充完善。

1.2.2 药物靶点筛选 药物识别过程是探索新药作用机制的重要过程，利用药物—靶点相互作用模型即CGPI模型和WES模型预测药物靶点［8-9］。随后，将预测的靶点映射到Uniprot数据库识别生物来源，限定与人类相关的靶点，同时校正基因名为官方标准名称［10］。最后，通过DAVID数据库进行GO富集分析（Gene Ontology enrichment analysis），筛选出与原发性痛经相关的靶点基因［11-12］。

1.3 构建活性成分—靶点网络 Cytoscape3.3.0软件是一个公开的生物网络资源［13］，根据药物分子和靶点的对应关系可构建分子—靶点网络图，利用插件Network Analyzer分析分子—靶点网络特征［14］，其中“节点”表示分子和靶点，“边”表示药物分子和靶点的相互作用。此外，作为重要的定量参数“度”用于评估节点在网络中的重要性，度的大小表示与节点相连的靶点的数量（见表1）。

1.4 构建生物通路，分析作用机制 将所有筛选的靶点映射进KEGG数据库，筛选出与原发性痛经相关的通路，利用Visio绘图软件绘制出整合的原发性痛经相关通路，阐释中药复方治疗原发性痛经的作用机制。

2 结果

2.1 香附活性成分筛选结果 通过TCMSP数据库、文献收集、ADME性质共筛选出14种活性成分（见表1）。虽然有些活性成分不完全符合ADME筛选条件，但是根据相关文献报道仍保留下来作为活性分子，例如编号为MOL13的活性成分α-香附酮（αcyperone），其类药性为 0.10，但温东婷等［15］证明 α-香附酮能抑制大鼠离体子宫自发性收缩，同时也可抑制由缩宫素引起的离体子宫的收缩，并呈剂量依赖关系，是香附中重要的活性成分。

2.2 香附靶点筛选结果与分析 通过CGPI模型和WES模型预测药物靶点、Uniprot数据库、DAVID数据库筛选出活性成分作用的靶点蛋白，最终得到83种靶点蛋白。根据与原发性痛经的相关性对靶点蛋白进行基因本体即GO分析，使用P-value＜0.05对靶点蛋白进行功能富集分析（见图1），其中血管生成的调节过程、炎症反应、一氧化氮合成过程显著性较高。

2.3 网络构建与分析 为了更好地了解不同的药物分子和靶点间的相互作用关系，将活性分子与作用靶点映射到Cytoscape软件中，得到药物活性分子—靶点网络，其中节点数97个，药物分子与靶点的相互作用关系187条（见图2），多数活性分子不只与单一靶点结合，而某些靶点也同时与多个活性分子连接，体现中药多分子、多靶点的特征。在网络中高度连接的活性分子和靶点蛋白如下：槲皮素、木樨草素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇，在网络中度的大小分别为66、32、27、16、10，靶点蛋白 ESR1、PTGS2、PPARG 的度分别是13、10、8；这些度较高的分子和靶点可能在香附的作用机制中起关键作用。

表1 香附活性成分筛选结果

图1 GO富集分析

图2 香附活性分子—靶点网络图

图3 香附治疗原发性痛经的信号通路

2.4 生物通路分析 在KEGG数据库中获得的与原发性痛经相关的通路有24条，其中大部分靶点蛋白集中在分布在VEGF信号通路、HIF-1信号通路、Toll样受体信号通路，关系到血管新生过程、低氧下细胞应激、炎症因子的表达，利用Visio绘图软件整合出与原发性痛经相关的信号通路，见图3。不会增加PGF2α的合成，从而减少子宫的异常收缩。此外，在活性分子—靶点网络中木犀草素（MOL01，luteolin）等10种活性分子同时调节PTGS2的表达，国内已有实验发现木犀草素可以抑制PTGS2的表达，而PTGS2是花生四烯酸代谢途径生成前列素类物质的关键合成酶，其表达受到抑制会减少前列腺素E2的释放［17］。网络分析表明，香附的有效成分通过协同作用增强或抑制靶点蛋白的表达，从而发挥药效作用。

本研究通过GO分析发现，靶点蛋白参与的生物过程多数与原发性痛经的病理机制相关，利用KEGG数据库整合出靶点蛋白参与的生物通路，这些信号通路主要集中于花生四烯酸代谢、血管相关因子和炎症因子表达等过程。VEGF信号通路中VEGF、VEGFR2、COX2靶点蛋白通过Ca2+磷脂依赖性激酶途径调节PGI2的生成过程，PGI2具有强大的抗凝作用，可以抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集和释放，防止血小板局部聚集形成血栓［18］；HIF-1信号通路是细胞低氧应激下的重要信号通路，HIF-1α会促进VEGF等血管生长因子的表达，有利于组织缺血后的恢复［19］，iNOS、eNOS等靶点蛋白参与血管调节因子一氧化氮（NO）的合成过程，NO是一种具有多种生物功能的分子，不仅可以舒张血管，调节外周的痛觉敏感性，而且参与调节子宫的收缩性［2，20］；Toll样受体信号通路中出现了TNF-α、IL-6、IL-8等炎症相关因子，这些炎症因子在

3 讨 论

目前治疗原发性痛经的药物主要是作用于生成前列腺素的花生四烯酸途径，然而该病与激素水平（前列腺素和雌、孕激素）、血管舒缩因子（一氧化氮、内皮素）、氧化应激因子（超氧化物歧化酶、丙二醛）等多种因素相关［15］，致病因素复杂多样，影响到不同的作用靶点和信号通路。中药香附成分复杂，作用广泛，可能与多个靶点和通路相联系，常作为中药复方中治疗原发性痛经的重要组成药物，如香附四物汤、艾附暖宫丸等，疗效显著。系统药理学从整体角度出发，综合分析药物活性成分、靶点及作用通路的关系，适用于中药多分子、多靶点的作用评估。本研究利用系统药理学方法筛选出香附的14种活性成分和83个可能的作用靶点，通过构建分子—靶点网络图直观地呈现了187条相互作用关系。在活性分子—靶点网络中 ，β - 谷 甾 醇 （MOL04，beta-sitosterol）、 豆 甾 醇（MOL07，Stigmasterol） 等都同时调节雌激素受体ESR1。β-谷甾醇、豆甾醇都属于植物甾醇类化合物，是天然的雌激素受体激动剂，可以作为雌激素受体激动剂的替代品［16］。相关研究报道雌激素含量增加会间接促进PGF2α的合成和释放，导致子宫收缩、血供不足引起痛经［2］。由此推测，香附活性分子可能与体内的雌激素竞争相应受体，产生类雌激素作用，但是痛经患者子宫内膜的浓度偏高，与痛经的发生紧密相关［21］；NF-κB是一种重要的转录因子，在整合的通路中调节上述炎症因子的表达，而相关研究已发现在低氧状态下NF-κB可能调节炎症因子IL-6的基因表达，在IL-6的转录过程中占有重要地位［22］，该发现从侧面证实了整合的信号通路的合理性。因此推测香附治疗原发性痛经不仅抑制花生四烯酸途径，而且调节其他与原发性痛经相关的病理过程，如血小板的聚集、血管相关因子（VEGF、iNOS等）、炎症因子（白细胞介素、TNF-α等）的表达，从而抑制血栓形成，促进组织修复，调节子宫的收缩性，达到缓解痛经的目的。

综上所述，香附治疗原发性痛经具有多分子、多靶点、多通路的特点，相关的通路存在复杂的调节机制，体现中医药治疗复杂疾病的优势。系统药理学方法可引导人们从新的角度审视原发性痛经的致病因素，研制出更有效的治疗原发性痛经的药物。