2D-LC/UV法测定苯妥英血药浓度的临床应用

院江丽，张寒娟，袁冬冬 （.郑州市第七人民医院药学部，河南 郑州 45006；2.新乡医学院药学院，河南 新乡 453003）

苯妥英是一种传统的抗癫痫药物，因其疗效显著，且镇静作用轻微，目前仍是全面强直阵挛发作的一线选用药物[1]。由于苯妥英具有饱和性药代动力学特点，而且治疗窗很窄，安全范围小，易发生血药浓度过高引起的毒性反应，故需要进行血药浓度监测来保证其治疗的安全性和有效性[2]。

随着现代分离分析技术的快速发展，二维色谱技术受到了体内药物监测越来越多的关注和重视[3]。二维色谱能使样品组分在两个不同的分离条件下进行分离，显著提高了分离能力，降低了色谱峰重叠，同时改善了色谱峰鉴定的可靠性。本研究探索二维液相色谱法在抗癫痫药苯妥英血药浓度监测方面的应用，并对实验的方法学进行验证，旨为药学工作者掌握新的药物监测方法提供参考。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

2D-LC/UV系统由岛津LC-20AT液相色谱部件和FLC 2420全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）构成；TDZ4-WS低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；Mini-15K微型高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）；GH-202电子分析天平（日本AND公司）；医用冰箱（合肥美菱股份有限公司）。

1.2 药品与试剂

苯妥英（批号：BZ150712，含量：99.0%，中国食品药品检定研究院）；VCV-1D移动相，BPI-1碱性流动相，API-1酸性流动相，MPI-1移动相，ACP-1去蛋白剂，ACG保护剂（均购于湖南德米特仪器有限公司）；空白马血清；纯水为怡宝纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

第一维色谱系统中，色谱柱：Aston SC2柱（4.6 mm×25 mm，5 μm），流动相为VCV-1D移动相（20.0 mmol·L-1磷酸铵-乙腈-甲醇= 3 : 1 : 1，磷酸调pH值至5.4），流速0.7 mL·min-1。捕集柱：Aston SH柱（3.0 mm×10 mm，5 μm），流动相为纯水。第二维色谱系统中，色谱柱：Aston SCB柱（4.6 mm×100 mm，5 μm），流动相为BPI-1碱性流动相∶API-1酸性流动相∶MPI-1移动相= 11∶37∶52（V∶V∶V），流速1.2 mL·min-1。柱温：40 ℃，紫外检测波长：240 nm，采用等度洗脱，进样量50 μL。FLC2420系统测定流程：样品通过自动进样器进样，在第一维色谱柱进行初步分离，样品中目标组分转移至捕集柱中，捕集柱中的目标组分在第二维流动相淋洗下进一步分离，被后端UV检测器检测。本实验时间程序设置见表1。

表1 FLC2420系统运行时间程序Tab 1 Time program for online column extraction of FLC2420

2.2 标准储备液的配制

精密称取苯妥英对照品4.98 mg，用25%异丙醇水溶液溶解并定容至10 mL，得苯妥英对照品的标准储备液，浓度为493.02 μg·mL-1，置- 20 ℃冰箱中保存，备用。

2.3 血液样品处理方法

血液样品低速离心（3000 r·min-1）5 min备用；准确吸取900 μL ACP-1去蛋白剂（12%高氯酸）至1.5 mL的EP管中，再准确加入300 μL血清，涡旋振荡1 min后，高速离心（14 500 r·min-1）8 min备用；再准确吸取100 μL ACG保护剂和1000 μL上清液至1.5 mL进样瓶中，震荡摇匀，备用。在“2.1”色谱条件下，进样50 μL，记录色谱图和峰面积，采用外标工作曲线法定量，将样品峰面积代入标准曲线，计算所得浓度。

2.4 色谱行为考察

在上述“2.1”色谱条件下，分别对空白血样、空白血样中加入对照品以及受试者服药后的血样进行测定，结果见图1。由图1可知，苯妥英的保留时间在6.30 min左右，峰形较好，血清中内源性杂质峰不干扰测定，专属性较好。

图1 2D-LC/UV色谱图A - 空白血样，B - 空白血样+苯妥英对照品，C - 受试者服药后的血样；1 - 苯妥英Fig 1 2D-LC/UV chromatogramA - blank serum, B - blank serum + phenytoin, C - serum after taking phenytoin; 1 - phenytoin

2.5 线性关系考察

将苯妥英标准储备液用空白马血清稀释成系列浓度溶液（1.54、3.08、6.16、12.33、24.65、49.30 μg·mL-1），按“2.3”项下方法处理并测定，以苯妥英的浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制工作曲线，得到线性回归方程为Y = 7.173 4×103X +8.718 8×103（r = 0.999 9），定量下限质量浓度为1.54 μg·mL-1（S/N＞10）。临床上苯妥英有效血药浓度为10 ～ 20 μg·mL-1，当血药浓度超过20 μg·mL-1易产生毒性反应，出现眼球震颤，超过30 μg·mL-1出现共济失调，超过40 μg·mL-1往往出现严重毒性。由此可见，所选线性范围包含其治疗浓度参考范围和实验室危急值，可满足临床测定范围的要求。

2.6 回收率和精密度

将苯妥英标准储备液用空白马血清稀释成高、中、低（49.30、12.33、3.08 μg·mL-1）3个浓度的工作液，按血液样品处理方法，在“2.1”色谱条件下测定3次，取平均值，代入标准曲线方程计算苯妥英的血药浓度，以实测值与加入质量浓度之比计算回收率。每个浓度设置6组平行，分别在同一天内测定6次计算日内精密度和连续6日内每日测定1次计算日间精密度。由表2的结果可知，本方法的回收率高于94%，日内、日间的精密度RSD值均小于3.53%，符合生物等效性研究的方法学要求。

表2 方法回收率及日内日间精密度. n = 6Tab 2 The recovery and intra-day and inter-day precision. n = 6

2.7 样品稳定性考察

将“2.6”项下的高、中、低浓度的工作液，分别在室温下放置24 h、反复冻融3次以及- 20 ℃冰冻保存30 d后按血液样品处理方法，在“2.1”色谱条件下，测定6次，取平均值。结果表明血浆中苯妥英稳定性良好，RSD均小于5%，详见表3。

表3 样品稳定性结果. n = 6Tab 3 The stability results of samples. n = 6

2.8 临床应用

采集30例口服苯妥英钠患者血清样本进行血药浓度检测。要求首次服药两周后，下一次服药前取静脉血2 mL，按血液样品处理方法，在“2.1”色谱条件下，测定苯妥英的血药谷浓度。结果在治疗窗浓度范围（10 ～ 20 μg·mL-1）之内有19例，超过治疗窗浓度范围有6例，低于治疗窗浓度范围有5例，其中不在治疗窗浓度范围的患者占总人数的36.7%。

3 讨论

苯妥英个体差异较大，一方面与其特殊的药代动力学特征有关；另一方面与患者用药依从性、服药剂量、药物相互作用、病理状况、以及年龄存在很大的关联[4]。不同的药品生产厂家生物利用度也存在差异[5-6]，应关注这一情况。因此患者服用苯妥英达到维持剂量后、每次剂量调整后及更换药品厂家后，都应当测定血药浓度， 这不仅可以提高药物治疗效果，也可避免或减少药品不良反应的发生。

目前苯妥英血药浓度的测定方法[7]主要有色谱法、免疫法[8-9]和光谱分析法。高效液相色谱法因灵敏度、精密度高，专一性强，应用范围广，已成为血药浓度监测中最常用的方法[10]。但该方法对样品的前处理要求非常高，必须完全去除大分子蛋白质及其他大分子物质，以最大程度地减少对分析柱的柱效的影响。免疫法监测药物浓度主要是利用蛋白竞争的原理进行监测的，这类方法样品处理简单，获取结果快，但仪器和试剂盒依赖进口，价格昂贵。紫外分光光度法专属性差，容易受血液中其它组分的干扰，单独应用于测定血药浓度时常常受到限制。

本研究采用的2D-LC/UV，该法是在单分离柱基础上发展起来的，其技术关键是联结两色谱分离系统之间的接口设备和技术[11]。通过色谱柱的二次分离，大大减少血中杂质的干扰，提高了检测结果的准确度；通过捕集柱的捕获和富集，缩短了分析时间，实现了样品的快速测定。采用该方法苯妥英单个检测样品可在7 min内测定完毕，提高了监测结果的反馈速度，有利于临床医师更好的指导合理用药。

综上所述，本研究建立的2D-LC/UV法测定苯妥英血药浓度的方法，具有前处理简单、自动化程度高、灵敏准确、快捷稳定等特点，能满足临床报告及时性、准确性和测定范围等要求，可以作为临床监测苯妥英血药浓度的有效方法。