国产氨酚氢可酮片人体生物等效性研究

郝光涛，马 蒙，曲恒燕，李媛媛，刘伟丽，张丽娟，刘泽源（.军事医学科学院附属医院药理室，北京 0007；.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 33030）

氨酚氢可酮片是活性成分为对乙酰氨基酚及重酒石酸氢可酮的复方制剂。对乙酰氨基酚是乙酰苯胺类解热镇痛药，通过抑制前列腺素的合成阻断痛觉末梢神经的传递，重酒石酸氢可酮是一种半合成的阿片类镇痛止咳药，主要作用于中枢阿片受体，不会逆转或拮抗同时应用的其他激动剂的作用；二者合用能同时作用于中枢神经系统和周围神经系统发挥协同止痛作用，使两种成分的镇痛作用相加，而副作用不相加，临床应用广泛[1-4]。本试验采用高效液湘-质谱-质谱（HPLC-MS-MS）法测定服用氨酚氢可酮片后人血浆中对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮的浓度，并对受试制剂的药动学特性、生物利用度及其与参比制剂的生物等效性进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱-串联质谱联用仪（岛津），其中，高效液相色谱系统包括二元输液泵、自动进样器、柱温箱，串联质谱仪为API 3200型三重四极杆串联质谱仪，含电喷雾离子化源以及串联三重四极杆质谱检测器；色谱工作站：Analyst 1.4.2数据处理软件（美国AB公司）。GL-88B旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；AB104电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；SIGMA 2K-15型高速低温离心机（美国SIGMA公司）；Milli-Q Plus纯水器（美国密理博中国有限公司）。

1.2 药品

受试制剂：氨酚氢可酮片（国药集团工业有限公司，规格：每片含重酒石酸氢可酮5 mg，对乙酰氨基酚500 mg，批号100406）；参比制剂：氨酚氢可酮片（美国华生制药股份有限公司，规格：每片含重酒石酸氢可酮5 mg，对乙酰氨基酚500 mg，批号211088B）。

对乙酰氨基酚标准品（中国药品生物制品检定所，纯度：99.3%，批号100018-200408）；内标：地西泮（中国药品生物制品检定所，纯度：99.0%，批号1230-9601）；重酒石酸氢可酮标准品（中国药品生物制品检定所，纯度：99.7%，批号171262-200701）；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，空白人血浆由军事医学科学院附属医院血液科提供。

2 方法与结果

2.1 研究对象

24名健康男性志愿者，平均年龄（32.13±2.74）岁，平均身高（1.71±0.05） m，平均体重为（64.04±4.06） kg，体重指数（21.96±0.99），经心电图、胸片、血常规、血生化、尿常规及肝、肾功能等检查均正常。受试者均无烟酒嗜好，受试前2周内未服用过任何药物，均自愿参加并签署知情同意书。本研究方案经军事医学科学院附属医院伦理委员会批准实施。

2.2 试验方案

本试验采用双周期自身交叉试验设计，单剂量口服给药，全部受试者随机进入2个试验组，每组12名。每组受试者每次试验时分别服用受试制剂或参比制剂。两次用药间隔7 d。

受试者于试验前一天晚上20∶00前入住药物临床试验机构Ⅰ期病房，22∶00开始禁食，第二天早上8∶00空腹用200 mL温开水送服1片氨酚氢可酮片，服药后2 h方可再饮水，4 h后统一进食低脂膳食。分别于给药前及给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16、24 h取上肢静脉血5.0 mL，肝素抗凝血样于常温下静置0.5 h后，3000 r·min-1离心10 min，上层血浆于- 20 ℃保存待测。

2.3 对乙酰氨基酚血药浓度测定方法

2.3.1 色谱和质谱条件 色谱柱：Agillent-C18柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流动相：甲醇-0.05%甲酸水溶液（85∶15）；柱温：室温；流速：0.2 mL·min-1；进样量：1 μL。

离子源：电喷雾离子化源（ESI源）；离子极性：正离子（positive）；离子检测方式：多反应监测（MRM）方式；喷射电压：4000 V；离子源温度：350℃；源内气体1（GS1，N2） 压力：30 psi；源内气体2（GS2，N2） 压力：60 psi；CE电压：19 V；Fragmentor电压：160 V；用于定量分析的离子反应对分别为质荷比m/z152.1→m/z110.1（对乙酰氨基酚）和m/z285.0→m/z193.0（地西泮，内标）。

2.3.2 血浆样品的处理与测定 精密量取50 μL血浆样品，置具塞玻璃试管中，依次加入50 μL内标溶液（500 μg·L-1地西泮溶液）、500 μL甲醇溶液，混合均匀，4 ℃，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液进样1 μL进行LC-MS-MS分析。

2.3.3 标准曲线的制备 取空白血浆50 μL，依次加入对乙酰氨基酚标准系列溶液50 μL和内标50 μL，配制成相当于对乙酰氨基酚血浆浓度为0.1、0.25、1、2.5、10、16、20 mg·L-1的血浆样品，按样品处理与测定方法进行测定，以样品浓度（X）为横坐标，对乙酰氨基酚峰面积与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标，用加权（W = 1/x2）[6]最小二乘法进行回归运算，得回归方程：对乙酰氨基酚Y= 0.666X+ 0.006 31，r2= 0.999 8。表明对乙酰氨基酚血药浓度在0.1～20 mg·L-1范围内呈良好线性关系，定量下限为0.1 mg·L-1。

2.3.4 方法学考察 在空白人血浆中加入不同量的对乙酰氨基酚制成低、中、高（0.25、2.5、16 mg·L-1）不同浓度的标准血样，每个浓度各6个样品，按上述测定方法分别测定日内、日间变异，结果见表1。

表1 HPLC法测定血浆中对乙酰氨基酚的准确度、精密度及回收率.n = 18Tab 1 Accuracy, precision and recovery of paracetamol in plasma with HPLC.n = 18

2.4 重酒石酸氢可酮血药浓度测定方法

2.4.1 色谱和质谱条 色谱柱：Agillent-C18柱（2.1 mm×50 mm, 3.5 μm）；流动相：甲醇-0.05%甲酸水溶液，梯度洗脱；流速：0.35 mL·min-1；梯度洗脱；柱温：室温；进样量：10 μL。

离子源：电喷雾离子化源（ESI源）；离子极性：正离子（positive）；离子检测方式：多反应监测（MRM）方式；喷射电压：4000 V；离子源温度：350℃；源内气体1（GS1，N2）压力：30 psi；源内气体2（GS2，N2）压力：60 psi；CE电压：19 V；Fragmentor电压：160 V；用于定量分析的离子反应对分别为质荷比m/z 300.2→m/z 199.1（重酒石酸氢可酮）和m/z 285.0→m/z 193.0（地西泮，内标）。

2.4.2 血浆样品的处理与测定 精密量取50 μL血浆样品，置1.5 mL具塞玻璃试管中，依次加入50 μL内标溶液（5 μg·L-1地西泮甲醇溶液）、补加1050 μL甲醇溶液，混合均匀，4 ℃ 15 000 r·min-1离心10 min，取上清液800 μL，40 ℃水浴氮气挥干，150 μL纯水复溶，进样10 μL进行LC-MS-MS分析。

2.4.3 标准曲线的制备 取空白血浆50 mL，依次加入重酒石酸氢可酮标准系列溶液50 μL和内标50 μL，配制成相当于血浆浓度为0.5、1、2.5、10、25、40、50 μg·L-1的血浆样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，制备工作曲线。以血浆中待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权（W = 1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程：Y = 0.069 6X＋0.022 6，r = 0.997 6，定量下限为0.5 μg·L-1。

2.4.4 方法学考察 在空白人血浆中加入不同量的盐酸羟考酮制成低、中、高（1、10、40 μg·L-1）不同浓度的标准血样，每个浓度各6个样品，按上述测定方法分别测定日内、日间变异，结果见表2。

表2 LC-MS-MS测定血浆中重酒石酸氢可酮方法的准确度、精密度及回收率.n = 18Tab 2 Accuracy, precision and recovery of hydrocodone bitartrate in plasma with LC-MS-MS.n = 18

2.5 血药浓度测定结果和主要药动学参数

经3p97药动学程序拟合，受试制剂与参比制剂在健康志愿者体内的血药浓度-时间过程均符合二室开放模型。两种制剂的平均药-时曲线详见图1；主要药动学参数详见表3，表4。测定结果与国内外文献基本一致。

图1 受试制剂和参比制剂的平均药-时曲线A-对乙酰氨基酚；B-重酒石酸氢可酮Fig 1 Mean plasma concentration-time curve of two preparationsA-paracetamol; B-hydrocodone bitartrate

2.6 相对生物利用度

将受试者口服受试制剂及参比制剂后的血药浓度数据以梯形面积法计算AUC0-tn，根据血药浓度-时间曲线末端血药浓度点，以LnC对t进行回归，求得消除速率常数ke；t1/2ke= 0.693/ke；Cmax、tmax为试验的实测值，AUC0-∞= AUC0-tn＋Ctn/ke（tn为最后一次可检测血药浓度的采样时间；Ctn为末次可测定样本的药物浓度）；CL/F= D/AUC0-∞（D为给药剂量）；Vd/F= （CL/F/Ke），根据Fr= AUC受试制剂/AUC参比制剂×100%求算受试制剂的相对生物利用度。结果显示，受试制剂中，对乙酰氨基酚的平均相对生物利用度为（93.04±12.06）%，重酒石酸羟可酮为（112.77±26.54）%。

表3 2种制剂中对乙酰氨基酚的主要药代动力学参数Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of paracetamol in two preparations

表4 2种制剂中重酒石酸氢可酮的主要药代动力学参数Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of hydrocodone bitartrate in two preparations

2.7 统计学处理及生物等效性分析

对受试制剂与参比制剂的主要药动学参数采用双单侧t检验进行分析，即将Cmax、AUC0-tn、AUC0-∞数据进行对数转换后进行多因素方差分析，结果详见表5。

表5 对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮AUC0-tn、AUC0-∞及Cmax双向单侧t检验表Tab 5 Two one-side test of AUC0-tn, AUC0-∞ and Cmax of paracetamol and hydrocodone bitartrate

由表5可见，采用双单侧t检验分析计算Cmax、AUC0-tn、AUC0-∞，对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮的T1、T2值均大于T0.1（18）= 1.717 1，显示2种制剂的药动学参数在试验的批间均无显著性差异（P＞ 0.05）。表明受试制剂与参比制剂生物等效。

3 讨论

本实验采用HPLC-MS-MS法分析人血浆中对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮的浓度，经方法学考察得出的回收率和批内、批间精密度均符合人体药动学研究和生物利用度测定的要求。采用质谱检测器，使检验灵敏度大大提高；对乙酰氨基酚和重酒石酸氢可酮均采用沉淀蛋白法后挥干的方法处理血浆样品，与文献液液萃取[5]相比，操作简单，节约成本，且定量下限较低。试验制剂和参比制剂的AUC0-tn、AUC0-∞及Cmax经对数转换后进行方差分析及双单侧t检验，结果显示，两种制剂在处方间与周期间无显著性差异（P＞ 0.05）。两种制剂的tmax经非参数法检验无显著性差异（P＞ 0.05）。根据以上结果判定试验制剂和参比制剂具有生物等效性。

本研究中未出现与试验相关的严重不良事件，没有受试者因为出现不良事件而退出本研究，研究结果可为中国人合理使用国产复方氨酚氢可酮片提供药代动力学依据。

[1] Rui Zhang, Benjie Wang, Chunmin Wei,et al.Determination and pharmacokinetic study of hydrocodone bitartrate in human plasma by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry[J].Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol,2009, 37(5)∶203-207.

[2] 向平，沈敏，沈保华，等.生物检材中吗啡类生物碱的LC-MS/MS分析[J].法医学杂志，2006，22（1）：52-54.

[3] 杨俊毅，蒋学华，林舒，等.RP-HPLC同时测定血浆中对乙酰氨基酚和咖啡因的浓度[J].华西药学杂志，2003，18（2）：110-112.

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[6] 钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J].药物分析杂志，1996，16（5）：343-346.