N-乙酰半胱氨酸对成年大鼠高氧肺损伤氧化应激机制的影响

刘庆辉，安 莉，石 敏，刘 岩，俞森洋 （解放军总医院南楼呼吸科，北京 100853）

急性缺氧性呼吸衰竭常需高浓度氧疗，但高浓度氧疗在改善机体供氧的同时也会引起肺结构和功能的异常，即高氧肺损伤[1]。高氧暴露可直接刺激活性氧种类（reactive oxygen species, ROS）的生成并导致细胞活性的改变，造成肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞结构和功能损害，从而导致严重的肺损伤，可见氧化应激反应是高氧肺损伤重要机制之一[2]。目前对新生或幼年动物的高氧肺损伤研究较多，而对成年动物的相关研究较为少见[3]。本研究探讨了成年大鼠高氧肺损伤发生的氧化应激机制，并观察了临床常用药物N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）预处理的影响，为探索防治高氧肺损伤的药物提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 动物

成年健康雄性清洁级SD大鼠48只（军事医学科学院动物实验中心提供），体重（302.2±12.8） g。

1.2 方法

1.2.1 实验设计 48只大鼠随机分为6组，每组8只。5组置入动物实验氧舱（中国烟台东科高压氧设备有限公司）中吸入100%浓度氧气，吸氧时间为24 h、48 h、72 h、96 h、96 h，作为24 h、48 h、72 h、96 h组和NAC干预组，并分别于0 h、24 h、48 h、72 h腹腔内注射NAC（200 mg·kg-1）预处理。还有1组吸入空气0 h作为0 h组。

1.2.2 标本收集 到达实验终点后，将大鼠移出氧舱，分离右侧颈总动脉并抽取动脉血。取出完整肺脏，称取全肺湿重。取右肺组织一小块用4%多聚甲醛溶液固定，剩余右肺组织立即放入冻存管，并置于液氮生物容器保存。肺组织匀浆制备：按每100 mg肺组织加入0.9 mL PBS（pH 7.4）的比例，冰浴下制成10%匀浆，3000 转·min-1离心20 min，取上清液－20 ℃冻存。

1.2.3 观察指标 根据动脉血气分析结果计算氧合指数（PaO2/FiO2），测定肺系数评价肺水肿的程度。肺组织及血清中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）活性测定采用相应的试剂盒。观察肺脏组织病理学变化。

1.2.4 统计学分析 实验数据采用chiss统计软件进行单因素方差分析，所测数据以（均数±标准差）表示。

2 结果

2.1 大鼠一般状况

24 h、48 h组大鼠呼吸较为平稳，口鼻红润；72 h组大鼠呼吸频率增快，活动减少；96 h组明显呼吸窘迫，口唇紫绀明显。同96 h组相比，NAC干预组大鼠呼吸困难程度明显减轻，口唇仅有轻度紫绀。

2.2 氧合指数

0 h组、24 h组、48 h组的氧合指数分别为（452.98±8.10）、（453.23±10.50）、（451.36±16.60），三组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。72 h组氧合指数为（368.16±20.66），明显下降，96 h组氧合指数为（123.39±11.46），达到最低值。NAC干预组氧合指数为（335.12±15.28），较96 h组显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 肺系数

随高氧暴露时间延长，大鼠肺系数呈逐渐增高趋势，24 h组为（0.63±0.05），0 h组为（0.60±0.07），两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；72 h组为（0.85±0.06），与48 h组（0.65±0.05）相比，显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；96 h组为（1.05±0.12），达到高峰，NAC干预组（0.86±0.06）同96 h组比较显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 肺组织和血清MDA含量

随高氧暴露时间的延长，大鼠肺组织和血清MDA含量逐渐增高，96 h达到峰值。NAC干预组较96 h组显著下降（见表1）。

表 1 六组大鼠肺组织和血清的MDA含量Tab 1 The contents of MDA in the lung and serum in six groups

2.5 肺组织和血清SOD活性

随高氧暴露时间的延长，大鼠肺组织和血清SOD活性呈逐渐下降趋势，96 h达到最低值。NAC干预组较96 h组SOD活性显著增高（见表2）。

表 2 六组大鼠肺组织和血清SOD活性Tab 2 The levels of SOD in the lung and serum in six groups

2.6 肺组织和血清T-AOC活性

随高氧暴露时间的延长，大鼠肺组织和血清T-AOC活性逐渐下降，96 h达到最低值。NAC干预组较96 h组T-AOC活性显著升高（见表3）。

表 3 六组大鼠肺组织和血清T-AOC活性Tab 3 The levels of T-AOC in the lung and serum in six groups

2.7 肺组织病理学改变

正常对照组肺组织形态结构清晰，无炎性细胞浸润。随着高氧暴露时间延长，肺泡壁增厚、结构破坏，出现炎性细胞浸润，以96 h组病理学改变最为明显。NAC干预组大鼠肺泡壁结构破坏、炎性细胞浸润及出血情况均较96 h组减轻。

3 讨论

急性缺氧性呼吸衰竭的救治通常需要进行高浓度氧疗，以保证重要脏器的氧气供应，但高浓度氧是一把双刃剑，在改善供氧同时也会引起机体肺结构和功能的损害，即高氧肺损伤，轻者影响患者的生活质量，重者可危及患者生命。对于早产或新生儿等正在发育中的肺组织，高氧甚至会造成不可逆的畸形发育，导致慢性肺疾病如支气管肺发育不良、肺气肿等[1]。高氧诱导的急性肺损伤主要的特征是：炎症细胞的聚集，肺组织通透性的增加以及血管内皮和肺泡上皮细胞的损伤和/或凋亡[4]。进一步探索高氧肺损伤的发病机制及探索相关的防治药物具有重要的理论及现实意义。

生理状态下体内存在少量的氧自由基，但由于氧自由基清除剂的存在，机体并不会出现严重的组织损伤。高浓度氧暴露后可直接导致体内氧自由基及ROS产生明显增多，造成肺泡上皮细胞的损伤，肺泡或间质的巨噬细胞发生应答，早期反应的细胞因子如TNF-α、IL-1β表达，从而活化肺内宿主细胞如内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞，导致趋化因子的产生，并通过一个复杂的网络调节这种炎症反应过程[5-6]。目前对于成年动物高氧肺损伤的研究较为少见，主要集中于新生或幼年动物的相关研究，但不同年龄组动物对高浓度氧的反应存在明显不同，细胞因子的表达和释放存在显著差异[3]。本研究选择成年大鼠作为研究对象，给予持续高浓度氧气吸入，观察成年大鼠高氧肺损伤的动态发展过程，能够更好的模拟成年人高氧肺损伤的肺部损害机制。

我们的研究结果表明，随着高浓度氧气暴露时间的逐渐延长，实验大鼠的氧合指数呈逐渐下降趋势，72 h出现显著下降，提示大鼠在72 h开始出现肺部损害，96 h氧合指数达到ARDS诊断标准，发生严重的肺损伤。肺系数随着吸入高浓度氧时间的逐渐延长呈逐渐增高趋势，并于96 h达到高峰，反映机体肺组织水肿程度随着高氧暴露时间的延长逐渐加重。MDA是氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化而形成的脂质过氧化产物。肺是富含脂质的器官，容易受到氧自由基的攻击，形成脂质过氧化物，脂质过氧化物进一步分解又能引起细胞的损伤[7]。本研究显示：随着高氧暴露时间的延长，肺组织和血清中MDA含量逐渐增加，96 h达到高峰，说明在高氧肺损伤时有大量的脂质过氧化物产生，这种氧化性损害持续存在，氧自由基与肺部脂质发生过氧化反应，引发脂质过氧化链锁反应所致。SOD是抗氧化酶类，SOD的高低可以间接反映机体清除氧自由基的能力[8-9]。本研究显示高氧暴露后SOD的活性逐渐下降，并持续存在于整个过程。高氧暴露后T-AOC逐渐下降，反映机体抗氧化能力下降。SOD、T-AOC活性下降和MDA含量升高反映了体内氧化/抗氧化平衡的失调。氧化/抗氧化失衡可以进一步引起蛋白质损伤、DNA损伤、改变信号传导通路、刺激转录因子活化、诱导细胞凋亡，引起肺组织的过度损伤。

N-乙酰半胱氨酸对多种呼吸道疾病如COPD、ARDS、肺间质纤维化等具有较好的治疗和预防作用[10]。作为一种氧自由基清除剂，在动物试验中NAC能够减轻LPS、氯气、光气等多种原因诱导所致的急性肺损伤[11-12]。已有研究表明，NAC通过诱导SOD的表达在一定程度上改善幼年或新生动物的高氧肺损伤[13]，尚未检索到NAC在成年动物高氧肺损伤的研究报道，而成年动物对高氧的病理生理反应与幼年动物不同[3]。我们的研究结果表明，NAC预处理后成年大鼠氧合明显改善，肺水肿程度减轻，肺组织及血清中MDA水平显著下降，SOD、T-AOC活性明显改善，提示NAC具有改善氧合，减轻大鼠肺水肿程度，并通过抑制机体氧化应激反应在一定程度上减轻高氧所致成年大鼠急性肺损伤，为探讨高氧肺损伤的药物防治提供新的依据。

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