黄芪多糖对食管鳞状细胞癌细胞肌动蛋白细胞骨架的影响

林珏龙，沈志忠，庄冰蓉，朴中贤，李伟秋，林丽吟

(1．汕头大学医学院中心实验室，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院第一附属医院耳鼻喉科，广东 汕头 515041)

食管癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一，在我国食管癌属高发疾病，每年新发病例约40万。潮汕地区是我国食管癌六大高发区之一，其死亡率一直居高不下[1]。研究食管癌治疗新的作用靶点和作用机制不仅是开发新型抗癌药物应对肿瘤化疗的有效手段，而且能够开发一些解决肿瘤化疗耐药性、纠正肿瘤药物敏感性的药物(如中医药制剂)以改善化疗效果。国内研究在利用中医药理论及临床实践基础上，在天然中药中发现多种具有抗癌作用和逆转化疗耐药作用的活性物质[2]。黄芪是一种常用的中药材，是抗肿瘤治疗的主要辅助中药。黄芪的化学成分主要有多糖、皂苷类和黄酮类等，黄芪多糖可通过提高机体的免疫功能而起辅助抗癌作用，能增强化疗药物的敏感性[3-4]。然而，黄芪多糖辅助抗癌的机制并不完全清楚。因此，本研究在食管癌细胞培养液中加入黄芪多糖，构建一个黄芪多糖作用于癌细胞的微环境，观察和分析黄芪多糖对食管癌细胞肌动蛋白骨架的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低分化食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞由汕头大学医学院病理教研室提供；1640培养基、胰酶、青霉素链霉素双抗均购自美国Gibco公司；核糖核酸酶A、碘化丙碇、牛血清白蛋白、荧光素异硫氰酸酯标记鬼笔环肽(Phalloidin-FITC)均购自美国Sigma公司；黄芪多糖购自北京索莱宝科技有限公司。LSM 800激光共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 KYSE-150细胞接种于含10%小牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的1640培养基中(培养皿内铺垫有多片盖玻片，细胞在盖玻片附着生长)，在37℃，体积分数为5% CO2的培养箱中培养12 h，生长密度为20%～30%时分为食管癌KYSE-150细胞组和KYSE-150细胞+黄芪多糖组，其中黄芪多糖终浓度50 mg/L。继续培养24 h，生长密度70%～80%。用0.15 mol/L，pH 7.2的PBS缓冲液洗去培养液，4%多聚甲醛固定30 min，PBS缓冲液洗涤1～2次，4℃保存。

1.2.2 细胞染色 含KYSE-150细胞的载玻片经PBS洗涤、吸净，20 μL 0.2% Triton X 100处理10 min；PBS洗涤、吸净，滴加15 μL Phalloidin-FITC(终浓度5～10 μg/mL)标记细胞内纤丝状肌动蛋白(F-actin)、同步加入10 μL RNA酶(终浓度50 μg/mL)，室温暗处静置2 h；PBS洗涤、吸净，滴加10 μL碘化丙碇(10 μg/mL)标记细胞内DNA，静置20 min；PBS洗涤、吸净。将各组含KYSE-150细胞的盖玻片置于洁净载玻片，制备可供激光扫描显微镜使用的标本。

2 结果

利用Phalloidin-FITC特异标记食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞的F-actin细胞骨架，经激光扫描共聚焦显微镜观测发现KYSE-150细胞沿着细胞膜内层形成粗大束状的F-actin骨架纤维，呈现由F-actin骨架支撑的细胞延伸交错形成的侵袭性伪足，癌细胞间彼此侵入，重叠生长；细胞间F-actin纤维支撑起的细胞膜状似微绒毛的结构短而少(图1A)。食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞经黄芪多糖诱导后，细胞膜内层F-actin骨架纤维变纤细、丰富，大量的F-actin纤维支撑起细胞膜，促使细胞膜形成丰富的微绒毛状结构(图1B)。

图1 食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞荧光染色 (Phalloidin-FITC，×400)

3 讨论

黄芪的主要活性成分有黄芪多糖、皂苷类和黄酮类等。研究显示黄芪多糖通过提高机体的免疫功能而起辅助抗癌作用，增强化疗药物的敏感性[3-4]；黄芪可增强癌症患者T淋巴细胞的功能，调节免疫功能[5]；黄芪注射液可增强树突状细胞的功能，产生抗肺癌作用[6]；黄芪可促进食管癌患者癌间质的肥大细胞和淋巴细胞的聚集，改善患者的免疫功能[7]。

食管鳞状细胞癌被诊断时通常已是晚期，患者的5年生存率较低，没有有效的靶向治疗药物[8]。因此，寻找靶向治疗或逆转食管鳞状细胞癌的药物并研究其作用机制至关重要。肿瘤的恶变是一系列多步骤和多阶段的过程，肿瘤细胞的抗药性是造成患者死亡的主要原因[9]。食管鳞状细胞癌的恶变是癌细胞侵入和迁移的过程，由肌动蛋白细胞骨架的动态组装促使癌细胞形成伪足和棘突(异形)结构而启动[10]。细胞中的肌动蛋白有球状肌动蛋白(G-actin)和F-actin，细胞G-actin的聚合和F-actin的解聚无时无刻不在发生。侵袭性的癌细胞依赖于其肌动蛋白细胞骨架的变化，影响F-actin应力纤维的形成和细胞的伸长[11]。许多癌细胞的侵袭性以F-actin为基础，细胞膜突出形成侵袭性伪足或侵袭体，侵袭周围的组织、血管和淋巴管[12-14]。通过调节细胞骨架可以改变细胞迁移，并且在调节癌细胞侵袭性方面有着潜在的作用[15-16]；干扰细胞组分F-actin的聚合，可抑制肿瘤的侵袭和转移[17]。

本研究利用Phalloidin-FITC特异标记食管鳞状细胞癌KYSE-150的F-actin细胞骨架，通过激光共聚焦显微镜观测发现：食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞沿着细胞膜内层形成粗大束状的F-actin骨架纤维，呈现由F-actin骨架支撑的细胞延伸交错形成的侵袭性伪足，癌细胞间彼此侵入，重叠生长。粗大束状的F-actin纤维减少了KYSE-150细胞表面的接触，细胞间F-actin纤维支撑起的细胞膜状微绒毛的结构短而少，此结构有利于KYSE-150细胞的浸入生长，是恶性生长癌细胞的细胞骨架特征。而经黄芪多糖诱导后，食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞的细胞膜内层F-actin骨架纤维变得纤细、丰富，大量的F-actin纤维支撑起细胞膜，促使细胞膜形成丰富的微绒毛状似结构，增加了细胞膜间的接触面积；细胞膜纤细、丰富的微绒毛延伸使细胞间不易形成相互侵入的重叠生长，构成癌细胞良性转化的细胞膜结构。肿瘤患者的最佳治疗方案是非细胞毒性药物治疗，非细胞毒性药物治疗可诱导恶性细胞的良性转化，通常伴有肌动蛋白细胞骨架的重组、细胞间黏附的提升、细胞运动的抑制和非锚定生长的丧失[18]。由此推测黄芪多糖诱导KYSE-150细胞F-actin骨架的重构，此变化有利于细胞间的信息交流，其结果可能促使癌细胞的良性转化。综上所述，黄芪多糖可能具有诱导低分化的食管鳞状细胞癌KYSE-150细胞良性转化的作用，可为中医药抗肿瘤的辅助治疗提供依据。