NF-κB反义RNA基因在超声联合微泡作用下对类风湿性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影响

刘 洁，景香香，杨炳昂，符少清，王东林，吴汤娜

（海南省人民医院，海南 海口 570311）

NF-κB反义RNA基因在超声联合微泡作用下对类风湿性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影响

刘 洁，景香香，杨炳昂，符少清，王东林，吴汤娜

（海南省人民医院，海南 海口 570311）

目的：观察NF-κB反义RNA基因在超声联合微泡作用下对类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的影响，探讨其对RA治疗的可行性。材料与方法：采用层-层吸附法将NF-κB反义RNA基因和多聚赖氨酸（Polylysine，PLL）分层吸附在自制的脂质超声微泡造影剂上，制备成载（PLL+DNA+PLL+DNA）的微泡。60只正常清洁级Wister雌性大鼠，分为6组（其中B～F组为造模成功后的RA大鼠），每组10只（20个膝关节）。A组：正常对照组；B组：RA大鼠模型对照组；C组：单纯NF-κB反义RNA基因组；D组：超声+NF-κB反义RNA基因组；E组：微泡+NF-κB反义RNA基因组；F组：超声+微泡+NF-κB反义RNA基因组。ELISA检测比较各组大鼠血清中的细胞因子TNF-α和IL-1β水平变化。结果：模型对照组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显高于正常大鼠组（P＜0.01），单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组、超声+微泡+基因组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于模型对照组（P＜0.05，P＜0.01），单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组3组之间比较无显著性差异（P＞0.05），超声+微泡+基因组与单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论：NF-κB反义RNA基因在超声联合微泡作用下对RA大鼠血清TNF-α、IL-1β水平有明显的下调作用，有助于提高RA的治疗效果。

关节炎，类风湿；白细胞介素1；肿瘤坏死因子α；超声检查，介入性

超声击破微泡造影剂介导基因转染的方法，具有安全、高效和靶向性好的优点，近年来已经在心脏、脑、角膜及肿瘤组织中得到实验证实[1-3]。本研究旨在观察该方法介导NF-κB反义RNA基因对类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）大鼠动物模型的治疗可行性，并通过观察RA大鼠血清中细胞因子TNF-α和IL-1β水平变化评价其治疗效果。

1 材料与方法

1.1 RA大鼠动物模型制备

60只正常清洁级 Wister雌性大鼠，体质量258～279 g，平均（261.57±5.42）g。福氏完全佐剂按4 mg/mL加入灭活的卡介苗，4℃保存备用。将Ⅱ型胶原溶解于0.01mol/L的乙酸中，使终浓度为4mg/mL，4℃搅拌过夜。将搅拌好的Ⅱ型胶原乙酸溶液按1∶1滴加至冷的福氏完全佐剂中，充分乳化。每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3点皮内注射乳化液共0.25mL，7 d后用同样方法加强注射1次。大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2 mm为造模成功。

1.2 载基因微泡的制备

采用层-层吸附法将NF-κB反义RNA基因和多聚赖氨酸（Polylysine，PLL）分层吸附在自制的脂质超声微泡造影剂上，制备成载 （PLL+DNA+PLL+ DNA）的微泡（重庆医科大学超声影像学研究所馈赠）。

1.3 实验动物分组

实验动物随机分为6组，1组为正常大鼠，5组均为RA大鼠模型，每组10只（20个膝关节）。A组：正常对照组；B组：模型对照组；C组：单纯NF-κB反义RNA基因组；D组：超声+NF-κB反义RNA基因组；E组：微泡+NF-κB反义RNA基因组；F组：超声+微泡+NF-κB反义RNA基因组。

1.4 基因转染方法

C组：单纯向大鼠关节腔内注射10 μg NF-κB反义RNA基因和300 μL生理盐水；D组：先将10 μg NF-κB反义RNA基因和300 μL生理盐水注射入大鼠关节腔内，再采用超声持续辐照10 min；E组：市售SonoVue（意大利Bracco公司）冻干粉一支，用5mL生理盐水（0.9%NaCl）稀释后，取300μL与10μg NF-κB反义RNA基因混合之后，4℃静置30 min，注射入大鼠关节腔内；F组：稀释后的SonoVue 300μL与10 μg NF-κB反义RNA基因混合，注射入大鼠关节腔内之后，再用超声（Philips HDI 4000）持续辐照10min。超声辐照条件已经在以前的实验中优化，探头频率10MHz，机械指数（MI）1.3，深度2cm。所有实验过程均保持仪器设置一致。

1.5 大鼠血清TNF-α及IL-1β水平检测

各组大鼠在治疗后30 d，股动脉采血，提取分离上清，按照TNF-α和IL-1β检测试剂盒的说明，采用ELISA方法检测大鼠血清TNF-α、IL-1β的水平。

1.6 统计学方法

本研究数据处理使用SPSS 13.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，本组数据资料经检验服从正态分布，组间比较采用方差分析（SNK法），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

大鼠RA动物模型：每只大鼠在左后足底、尾根部、背部分3点皮内注射乳化液，7 d后加强注射1次，14 d后大鼠四肢足爪均严重肿胀、踝关节直径增长幅度≥2 mm，并经病理切片证实成功建立RA模型（图1）。

各组大鼠血清TNF-α及IL-1β水平检测结果见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α及IL-1β水平的比较（±s）

表1 各组大鼠血清TNF-α及IL-1β水平的比较（±s）

注：与正常对照组比较，1：P＜0.01。与模型对照组比较，2：P＜0.05，3：P＜0.01。单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组3组之间比较，4：P＞0.05。超声+微泡+基因组与单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组比较，5：P＜0.05。

组别 膝关节数（n） TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L）正常对照组 10 32.68±9.23 2.45±0.24模型对照组 10 90.12±16.14110.10±2.011单纯基因组 10 72.12±10.272，47.57±1.482，4超声+基因组 10 69.28±11.852，46.98±1.872，4微泡+基因组 10 70.64±15.292，48.10±1.292，4超声+微泡+基因组 10 51.29±11.833，54.69±0.973，5

图1 大鼠RA动物模型。图1a：正常大鼠关节，病理切片可见滑膜细胞基本呈单层整齐排列（HE）。图1b：RA大鼠关节明显肿胀，病理切片可见滑膜细胞明显增生，排列紊乱，毛细血管明显扩张充血（HE）。Figure 1.Rat model of RA.Figure 1a:Normal rat joints.The pathology slice shows that synovial cells are arranged regularly in a monolayer(HE).Figure 1b:Joints of RA rats are significantly swollen.Pathology slice shows significant proliferation and disorganization of synovial cells.Capillaries are significantly dilated and congested(HE).

3 讨论

RA是关节疾病中最常见的一种以慢性炎症、异常免疫反应和滑液增多为特征的全身性自身免疫性疾病。到目前为止，RA的发病机制不十分清楚，因此尚无满意的治疗方法。国内外研究表明，基因治疗在RA疾病方面显示出了较好的前景[4-6]。

多数学者认为RA的启动是通过提呈抗原给CD4+淋巴细胞，两者相互作用从而激活了淋巴细胞。活化的淋巴细胞刺激单核-巨噬细胞释放单核因子，特别是TNF-α和IL-1β。这些单核因子是主要的前炎症细胞因子，对关节实质细胞和内皮细胞具有广泛的作用，在形成RA炎症、新生血管生成和骨质破坏中起着重要的作用。RA病人血液和滑液中存在大量TNF-α，滑膜组织中巨噬细胞和内皮细胞能表达抗原性TNF-α。动物实验表明，小鼠转入TNF-α基因，可持续表达TNF-α，自发产生类似RA的关节炎，抗TNF-αmAb能减轻TNF-α转基因小鼠以及胶原诱导的关节炎模型小鼠的炎症。在RA中，IL-1β是最强的骨吸收剂，尤其局部IL-1β的水平抑制软骨修复的作用与TNF-α协同增强且较TNF-α更为重要；IL-1β可通过上调核因子NF-κB配基的受体激活剂活性，直接增强破骨细胞骨侵蚀吸收能力，导致骨的破坏，同时抑制Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的合成，抑制软骨细胞的修复重建，最终引起关节软骨、骨的损伤；IL-1β也可作用于成骨细胞，诱导NF-κB配基的受体激活剂的表达，它可刺激破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞，并进一步使其活化，加速骨侵蚀。由此可见，TNF-α和IL-1β在RA的发生和进展中起着决定性作用。

核转录因子是一类蛋白质，具有和某些基因上启动子区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能。自1986年被发现以来，许多以NF-κB为作用靶点治疗或缓解疾病的研究已相继报道。在这些研究中，NF-κB与RA的相关研究成为热点之一，其已被证实在成人RA发病中起关键作用。在免疫介导的RA的炎症、增生和骨侵蚀三大病理过程中，NF-κB都起着中心调节作用。以NF-κB为靶点，针对其信号通路中的各个环节抑制其活化，目前已成为抗炎、抗风湿治疗研究的热点，具有广阔的临床应用前景。

本实验选用反义RNA技术，人工合成NF-κB反义RNA基因质粒，通过抑制滑膜组织中NF-κB的表达，以NF-κB为靶点，抑制RA的发生和发展过程中各个环节的活化，最终达到抑制或减轻RA疾病的目的。

近年来，超声造影剂微泡作为一种新型的、安全的、高效的基因靶向载体，是国内外研究的热点课题。研究表明超声照射本身就可以促进基因在体外和体内的转染，而超声通过击破造影剂微泡，令进入血液循环中的微泡在指定部位“爆破”，释放所携带的基因，微泡爆破产生的振荡可增加真核细胞的通透性，有利于DNA分子穿透，提高了基因转导和表达的效率[7]。近年来，体内外试验均证明造影剂微泡在超声作用下可增加外源基因转染率和表达水平[8-10]。

我们也做了大量有关超声微泡介导将空质粒转染正常大鼠关节滑膜组织的研究，验证了超声联合微泡这种基因转染方法在关节疾病中应用的可行性，摸索了保证基因转染成功的客观条件[11-13]。在本研究中，我们应用超声微泡介导这种新型的基因转染方法，以NF-κB反义RNA为靶基因，进行RA的治疗。本实验发现，造模后，RA大鼠血清TNF-α和IL-1β水平明显升高（与正常对照组比较，P＜0.01），提示这两种细胞因子在RA的病理过程中发挥了重要作用。单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组、超声+微泡+基因组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于模型对照组（P＜0.05，P＜0.01），单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组3组之间比较无显著性差异 （P＞0.05），超声+微泡+基因组与单纯基因组、超声+基因组、微泡+基因组比较有显著性差异 （P＜0.05）。实验结果证明，所有实验组均具有一定的治疗作用，但是超声+微泡+基因组的治疗效果更显著，提示超声和微泡的联合作用可以明显提高基因的转染效率，增强基因治疗的疗效。

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The effects of NF-κB antisense RNA gene on the levels of serum TNF-α and IL-1β in rheumatoid arthritis rats by ultrasound-mediated microbubble destruction

LIU Jie,JING Xiang-xiang,YANG Bing-ang,FU Shao-qing,WANG Dong-lin,WU Tang-na
(Hainan Provincial People’s Hospital,Haikou 570311,China)

Objective:To investigate the effect of NF-κB antisense RNA gene delivery mediated by ultrasound-mediated microbubble destruction on serum levels of TNF-α,IL-1β in rheumatoid arthritis(RA)rats and its feasibility for RA therapy.Methods:The layer-by-layer assembly technique was applied to attach multiple layers of gene and polyllysine onto prepared lipid-coated microbubbles(PLL+DNA+PLL Apply+DNA).Sixty rats were divided into six groups(10 rats with 20 knees in each group).Group A:normal control group;group B:blank control group of RA rats;group C:NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group D:ultrasound+NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group E:microbubbles+NF-κB antisense RNA gene plasmid group;group F:ultrasound+microbubbles+NF-κB antisense RNA gene plasmid group.The serum levels of TNF-α,IL-1β in RA rats were detected with ELISA.Results:The levels of serum TNF-α and IL-1β were obviously higher than normal control group.Those of group C to F were notably lower than that of the RA control group(P＜0.05,P＜0.01).There was no statistical difference in the levels of serum TNF-α and IL-1β among group C,D and E.But there was statistics difference between group F and group C to E(P＞0.05).Conclusion:NF-κB antisense RNA gene transfection efficiency on RA rat’s joints synovial tissues can be enhanced by ultrasound-mediated microbubble destruction,which can down-regulate the levels of serum TNF-α and IL-1β,and enhance the therapeutic effect of RA.

Arthritis,rheumatoid;Interleukin-1;Tumor necrosis factor-alpha;Ultrasonography,interventional

R593.22；R445.1

A

1008-1062（2016）12-0896-03

2016-03-28；

2016-06-02

刘洁（1970-），男，山西孝义人，主治医师。E-mail：383432303＠qq.com

景香香，海南省人民医院超声科，570311。E-mail：jingxiangxiang＠sohu.com

国家自然科学基金（30860270）；海南省自然科学基金（30854，813208）。