磁共振灌注成像评估瑞加德松开放血脑屏障的初步研究

常灿灿，周军，杨本强，李虹易，徐志华，林森，段阳

（1.沈阳军区总医院放射科，辽宁沈阳110016；2.沈阳第四人民医院放射科，辽宁沈阳110031）

磁共振灌注成像评估瑞加德松开放血脑屏障的初步研究

常灿灿1，周军2，杨本强1，李虹易1，徐志华1，林森1，段阳1

（1.沈阳军区总医院放射科，辽宁沈阳110016；2.沈阳第四人民医院放射科，辽宁沈阳110031）

目的：利用MR灌注成像（MR PWI）评价瑞加德松对兔脑血脑屏障的开放程度。方法：50只新西兰大白兔随机分为实验组（A组）和对照组（B组），分别经耳缘静脉注入瑞加德松和生理盐水，延迟10 min后行MR PWI扫描。比较分析两组感兴趣区rCBF、rCBV、TTP及MTT参数值差异（配对t检验）。各组随机选5只兔子，图像采集后即刻静脉注入2%伊文氏蓝，1小时后处死取脑组织观察蓝染情况。结果：A组感兴趣区rCBF、rCBV较B组明显增高，脑组织蓝染明显，有统计学差异（P＜0.05），TTP值、MTT值在两组间无明显差异（P＞0.05）。结论：MR PWI的参数rCBF和rCBV可在体监测瑞加德松开放血脑屏障的程度。

血脑屏障；磁共振成像

中枢神经系统疾病的治疗药物不能很好的发挥治疗作用的重要原因是由于血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）这一天然的生理屏障的存在[1]。因此，如何安全有效的开放BBB，提高药物治疗的疗效成为近年来的研究热点。瑞加德松是首个A2a腺苷受体激动剂，可通过激活A2a腺苷受体，促进冠脉舒张和增加冠脉血流量，在心肌灌注造影研究中显示其应激安全、有效[2]。相关研究报道其具有短暂开放BBB的作用，但是评价其BBB开放程度的影像学研究尚未见报道。本研究旨在探讨瑞加德松开放BBB的可行性，并通过磁共振灌注成像（MR perfusion weighted imaging，MR PWI）来进行在体评价和检测，初步探讨BBB开放的程度。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组

成年健康家兔50只（动物实验中心提供），不分雌雄，体质量（3～4 kg），随机分为实验组（A组）和对照组（B组），每组25只，分别经耳缘静脉注入瑞加德松和生理盐水，而后延迟10 min进行MR PWI扫描，实验前兔子自由饮水。

1.2 药物和材料

美国GE公司Discovery D750 3.0T MRI超导型磁共振；瑞加德松注射液5 mL（0.4 mg）；钆喷酸葡胺注射液（DTPA，0.4 mL/kg）；Sigma 2%伊文氏蓝溶液；pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS溶液）；二甲基亚砜。GE公司AW 4.6后处理工作站；Medrad公司的双筒自动高压注射器。国产24G×19mm静脉留置针。

1.3 实验动物准备

实验前家兔8 h禁食，自由饮水，所有家兔均经腹腔注射4%水合氯醛（0.3 mL/100 g），观察其达到满意的麻醉状态后，由耳缘静脉放置24 G静脉留置针并妥善固定。将家兔仰卧位固定于特制木板上后置于扫描床上，连接高压注射器与静脉留置针。术中根据情况适量追加麻醉剂及补充生理盐水。

1.4 检查方法

采用Discovery D750 3.0T MRI超导型磁共振成像系统和膝关节正交线圈，兔头部置于线圈中心，以基底节区为中心冠状位扫描，层厚3 mm，层间距1 mm。

采用平面回波自由衰减序列连续扫描50次，在采集第4次图像后经耳缘静脉快速团注0.3 mmol/kg的Gd-DTPA，注射流率1 mL/s，立即团注5 mL生理盐水，2～4 s内完成注药，每个扫描层面产生50帧连续的图像，共650幅灌注图像。PWI扫描参数为TR蛐TE=850蛐40 ms，FOV 12 cm，矩阵96×96，NEX：1，翻转角90°，1 s蛐次，共50次，扫描时间1分25秒。

1.5 图像后处理

MR PWI原始图像转到GE公司AW 4.6后处理工作站进行图像后处理，采用Functool软件据磁化敏感造影剂造成的每个像素信号下降的程度，计算出信号强度-时间曲线，进而构建出每层扫描图像的灌注伪彩图像，分别为相对局部脑血容量（rCBV）图、相对局部脑血流量（rCBF）图、平均通过时间（MTT）图和对比剂峰值时间（TTP）图。选取基底节层面，分别在基底节区、兔脑皮层区和对侧相应区域选择4个感兴趣区（ROI，3～4 mm2），计算其rCBV、rCBF、MTT、TTP值，取平均值，A、B两组进行比较。

1.6 伊文氏蓝染色

A、B两组各随机抽取5只兔脑图像采集后即刻静脉注入2%伊文氏蓝，循环1 h后左心室灌注处死取脑，进行脑组织冰冻切片，采用荧光显微镜观察脑组织细胞荧光亮度及荧光物质的分布。

1.7 统计学分析

引用SPSS 17.0统计软件进行分析，两组数据之间比较采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组兔脑冠状面灌注伪彩图像结果

实验组rCBV、rCBF图较对照组出现明显的高灌注区，且主要分布于基底节区和血管走形区周围。实验组与对照组之间MTT图、TTP图未见明显改变（图1～6）。

2.2 两组兔脑各灌注参数结果

对两组兔脑感兴趣区各参数进行配对t检验，实验组rCBF、rCBV较对照组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05)，而MTT值、TTP值则未见明显差异，P＞0.05（表1）。

2.3 荧光显微镜观察

实验组兔脑感兴趣区可见明亮的红色荧光，神经细胞也可见鲜艳的红色荧光，而对照组感兴趣区未见确切的荧光（图7）。

Table 1Comparison of MR cerebral perfusion parameter values of basal ganglia and cortex of rabbit brain in two groups

3 讨论

BBB是存在于血液和脑组织之间的一种生物屏障系统，主要由毛细血管内皮细胞及其基膜、内皮之间形成的紧密连接、毛细血管周围的神经胶质细胞等结构构成[3]。BBB通过内皮血细胞之间的紧密连接限制了大分子物质甚至许多小分子物质进入中枢神经系统内，从而对脑组织内环境的稳定起到重要作用[4]。正是由于BBB的存在，在病理状态下，使许多治疗药物或诊断试剂也难以逾越BBB进入脑组织发挥治疗作用[5]。因此，国内外学者致力于研究如何短暂、安全、可逆地增加BBB的通透性，使脑组织内药物达到更大治疗浓度，提高脑内疾病治疗疗效。已有的一些方法包括：经动脉灌注高渗性甘露醇溶液使脑微血管内皮细胞萎缩，细胞之间的间隙增大，BBB通透性增加[6-7]，但是这种高渗性开放BBB会引起癫痫发作，不能重复应用[7]，未取得好的临床应用价值，只局限于动物实验中；另外，直接向脑室内注入药物来开放BBB的侵入性方法会对脑组织造成伤害[8-9]；治疗性物质可以与一些因子连接，这些因子可以激活受体依赖性细胞内吞作用，但是BBB内吞作用能力有限，并且相关受体的表达需要充分[10]；利用化学物质携带载体，例如增加亲油性但是需要增加药物的大小从而限制了细胞通透的能力[11]。这些方法均不同程度对神经组织有害，可以造成脑组织损伤，因而难以实现临床应用。

图1 ～6基底节区冠状面MR PWI参数图。a图为实验组，b图为对照组。图1：兔脑MR T2WI冠状面定位图像。图2：兔脑各个感兴趣区的时间-信号变化曲线。图3：兔脑脑血流量伪彩图（rCBF图）。图4：兔脑脑血容量伪彩图（rCBV图）。图5：兔脑平均通过时间（MTT图）。图6：兔脑对比剂峰值时间（TTP图）。对照组感兴趣区rCBV、rCBF、MTT、TTP图像显示对称性灌注，未见异常灌注区，而实验组相同感兴趣区rCBV、rCBF呈散在分布高灌注，且高灌注区主要分布于血管走形区周围。MTT、TTP图未见明显改变。Figure 1～6.Coronal MR PWI parameter images of basal ganglia region.Figure a represented experimental group,Figure b represented control group.Figure 1:The coronal-locating images of MR T2WI.Figure 2:The time-signal curves.Figure 3:The relative cerebral blood flow color map(rCBF).Figure 4:The relative cerebral blood volume color map(rCBV).Figure 5:The mean transit time color map(MTT).Figure 6:The time to peak color map(TTP).The color map of rCBV,rCBF,MTT,TTP of the ROI showed symmetrical and normal perfusion in control group,while there were diffused hyper infusion area in the same ROI which were distributed around the vessels.The color maps of MTT, TTP had no significant difference between two groups.

图7 荧光显微镜观察。图7a：实验组兔脑感兴趣区可见明亮的红色荧光，神经细胞也可见鲜艳的红色荧光。图7b：对照组感兴趣区未见确切的荧光。Figure 7.Fluorescence microscope.Figure 7a:There was no positive fluorescence in the ROI of the control group.Figure 7b:There was bright red fluorescence in the ROI of the experimental group,meantime,in the nerve cell.

近年来，随着分子生物学、免疫学及相关学科的发展，腺苷受体与BBB之间的关系取到了进一步认识。腺苷受体激活途径代表了一种新型的、内源性调节BBB通透性的机制。瑞加德松作为一种新型的A2a受体激动剂，通过激活脑微血管内皮细胞A2a受体，可诱导肌动蛋白应力纤维形成，进而重构细胞骨架[12-13]，引起细胞形态发生改变，致使细胞间缝隙增宽、增多。Carman等[14]研究发现，BMEC之间紧密连接蛋白的表达在腺苷受体激活后的明显下调，以Occludin的改变为著。另外这一过程中血管内皮单层细胞跨膜电阻会降低，这一系列的变化使BBB中脑微血管内皮细胞之间的间隙增大，处于松弛状态，相当于血管容积和毛细血管血流量增大。而MRPWI正是用于反应组织微血管的血流灌注状况的一种功能性成像方法[15]，因此，本研究试图用MR PWI来评价瑞加德松注射液对兔脑BBB的开放。

本实验结果显示瑞加德松进入兔血液循环10min后，MR PWI显示兔脑组织感兴趣区的血流灌注参数发生改变，rCBF、rCBV值较空白对照组明显升高，差异具有统计学意义，且rCBF图、rCBV图显示出高灌注区。rCBV反映特定区域内毛细血管和大血管床容积，rCBF为单位时间内流经特定脑区域的血液容量，代表组织的毛细血管流量，且相关研究表明[16-18]在MR PWI评估胶质瘤分级中灌注参数rCBV和rCBF具有良好的相关性。本实验结果二者明显升高，差异具有统计学意义，说明瑞加德松进入血液循环后可能引起毛细血管和大血管床容积增大，毛细血管血流量增加，rCBF、rCBV值增大，BBB通透性增加，BBB开放。实验组和对照组MTT值、TTP值之间无明显差异，瑞加德松造成兔脑组织局部BBB毛细血管内皮细胞间隙增大，血管床容量升高，从rCBF、rCBV图可以看出这种改变的范围较散在分布，对血液的平均通过时间和对比剂达峰时间未见造成明显影响，且在诸多关于脑胶质瘤肿瘤血管灌注成像评价中MTT值、TTP值由于血管的自动扩张导致很难准确测量[19]，因此MTT值、TTP值的价值有待深入探讨。

同时，利用EB失踪法显示兔脑大体标本对照组脑组织未见明显异常蓝染，实验组大脑表面不同程度蓝染。经冰冻切片，在荧光显微镜下观察，发现实验组脑组织脉络丛表面、嗅结节、纹状体和听神经核，其次是脑膜、大脑皮层和海马区域被激发出明亮的红色荧光，对照组相应区域无明显的红色荧光物质，从而证实瑞加德松对BBB的开放。

综上所述，本实验研究表明瑞加德松作为一种选择性腺苷受体激动剂，通过激活BBB上内源性腺苷受体，可以引起BBB的开放，同时利用MR PWI的灌注参数的变化可以在体监测BBB的开放程度，为临床上促进治疗药物跨越BBB进入脑组织提供一种在体定量无创检测的影像学方法。

本实验不足之处在于未对瑞加德松对BBB开放的时间窗行探讨和分析总结，由于受到经费和设备的限制未能使用相应的小动物头部线圈进行MR图像采集。

[1]Daneman R,Barres BA.The blood-brain barrier-lessons from moody flies[J].Cell,2005,123(1):9-12.

[2]Agarwal V,DePuey EG.Regadenoson and seizures:a real clinical concern[J].J Nucl Cardiol,2014,21(5):869-870.

[3]Rajadhyaksha M,Boyden T,Liras J,et al.Current advances in delivery of biotherapeutics across the blood-brain barrier[J].Curr Drug Discov Technol,2011,8(2):87-101.

[4]Abbott NJ,Patabendige AA,Dolman DE,et al.Structure and function of the blood-brain barrier[J].Neurobiol Dis,2010,37(1): 13-25.

[5]Hossain S,Akaike T,Chowdhury EH.Current approaches for drug delivery to central nervous system[J].Curr Drug Deliv, 2010,7(5):389-397.

[6]Pardridge WM.The blood-brain barrier:bottleneck in brain drug development[J].NeuroRx,2005,2(1):3-14.

[7]Marchi N,Angelov L,Masaryk T,et al.Seizure-promoting effect of blood-brain barrier disruption[J].Epilepsia,2007,48(4):732-742.

[8]Cook AM,Mieure KD,Owen RD,et al.Intracerebroventricular administration of drugs[J].Pharmacotherapy,2009,29(7):832-845.

[9]Jenne JW.Non-invasive transcranial brain ablation with high-intensity focused ultrasound[J].Front Neurol Neurosci,2015,36: 94-105.

[10]Yu YJ,Atwal JK,Zhang Y,et al.Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates[J].Sci Transl Med,2014,6(261):261.

[11]Witt KA,Gillespie TJ,Huber JD,et al.Peptide drug modifications to enhance bioavailability and blood-brain barrier permeability[J].Peptides,2001,22(12):2329-2343.

[12]赵博贤，毕云科，李宪峰，等.腺苷受体与血脑屏障通透性研究进展[J].临床神经外科杂志，2013，10（4）：248-250.

[13]Prasain N,Stevens T.The actin cytoskeleton in endothelial cell phenotypes[J].Microvasc Res,2009,77(1):53-63.

[14]Carman AJ,Mills JH,Krenz A,et al.Adenosine receptor signaling modulates permeability of the blood-brain barrier[J].J Neurosci,2011,31(37):13272-13280.

[15]Villringer A,Rosen BR,Belliveau JW,et al.Dynamic imaging with lanthanide chelates in normal brain:contrast due to magnetic susceptibility effects[J].Magn Reson Med,1988,6(2): 164-174.

[16]Provenzale JM,Wang GR,Brenner T,et al.Comparison of permeability in high-grade and low-grade brain tumors using dynamic susceptibility contrast MR imaging[J].Am J Roentgenol, 2002,178(3):711-716.

[17]Morita N,Wang S,Chawla S,et al.Dynamic susceptibility contrast perfusion weighted imaging in grading of nonenhancing astrocytomas[J].J Magn Reson Imaging,2010,32(4):803-808.

[18]周丽，付旷，郭丽丽，等.3.0T磁共振灌注加权成像在脑胶质瘤诊断中的价值[J].中国实验诊断学，2013，17（2）：275-278.

[19]陆娜，冯晓源，邸悦，等.CT灌注成像评价人脑胶质瘤肿瘤血管生成[J].中国医学计算机成像杂志，2014，20（6）：481-484.

Preliminary study on assessment of regadenoson-induced blood-brain barrier
opening by MR perfusion weighted imaging

CHANG Can-can1,ZHOU Jun2,YANG Ben-qiang1,LI Hong-yi1,XU Zhi-hua1,LIN Sen1,DUAN Yang1
(1.Department of Radiology,the General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China; 2.Department of Radiology,Shenyang the Fourth Hospital of People,Shenyang 110031,China)

Objective:To evaluate the level of regadenoson-induced blood-brain barrier opening of healthy rabbits via MR perfusion weighted imaging(MR PWI)scan.Methods:Fifty New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental group(group A)and control group(group B).The regadenoson and normal saline were injected intravenously into ear margin separately,after 10 minute,MR PWI scan was performed.Then rCBF,rCBV,TTP and MTT of the region of interest of each group were acquired and compared statistically(paired t test).Five cases of each group choosed randomly were injected with 2%Evens blue intravenously posterior to imaging.After one hour of infusion,all the animals were killed.Their brains were examined for the determination of Evens blue distribution.Results:The rCBF and rCBV values and the staining with Evens blue of group A were significantly higher than those of group B(P＜0.05).There were no significant differences of TTP and MTT values between group A and B(P＞0.05).Conclusion:The parameters(rCBF,rCBV)of MR PWI scan can monitor the level of regadenoson-induced blood-brain barrier opening in vivo.

Blood-brain barrier;Magnetic resonance imaging

R338；R972；R445.2 [

]A [

]1008-1062（2016）10-0690-04

2016-01-07；

2016-03-07

常灿灿（1991-），女，安徽亳州人，医师。E-mail：853348688@qq.com

段阳，沈阳军区总医院放射科，110016。E-mail：duanyang100@126.com

本文课题受辽宁省科技攻关基金项目（编号：2012225019）资助。