Ⅰ～Ⅱ期糖尿病肾病大鼠模型扩散张量成像的初步研究

胡小艳，邬颖华，郭 亮，匡 敏，王 钒

（1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.中国医科大学，辽宁 沈阳 110001；3.成都中医药大学附属医院放射科，四川 成都 610075）

Ⅰ～Ⅱ期糖尿病肾病大鼠模型扩散张量成像的初步研究

胡小艳1，邬颖华1，郭 亮2，匡 敏1，王 钒3

（1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.中国医科大学，辽宁 沈阳 110001；3.成都中医药大学附属医院放射科，四川 成都 610075）

目的：探讨Ⅰ～Ⅱ期糖尿病肾病大鼠模型磁共振张量成像（DTI）表现及变化规律。材料与方法：20只SD雄性大鼠，按随机数字表法将大鼠分为2组，实验组14只，实际存活9只，共18个肾脏，对照组6只，共12个肾脏；实验组给予1%链脲佐菌素腹腔注射造模，对照组给予同等剂量的柠檬酸缓冲液（pH 4.5）；2周后对两组大鼠行常规MRI检查及DTI检查，在6个非共线方向上施加扩散敏感梯度场，b值取0、600 s/mm2；并留取血尿标本测量尿微量白蛋白、血肌酐；取双肾行病理检查；由两名经验丰富的放射科医师盲法观察及测量双侧肾脏皮质、髓质兴趣区的ADC值和FA值。结果：实验组大鼠血糖明显升高，两组血肌酐、尿微量白蛋白均正常；实验组动物大鼠双肾病理表现为Ⅰ～Ⅱ期DN损害，对照组大鼠双肾病理均正常；实验组大鼠皮、髓质ADC值较对照组增大，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组皮、髓质FA值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组皮、髓质FA值与对照组皮、髓质FA值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：DTI成像的ADC值和FA值能够在一定程度上，较血尿生化指标更能反映早期DN的病理改变。

糖尿病肾病；磁共振成像

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症。目前，临床诊断DN主要依靠血生化检测及肾穿刺活检，但前者不能早期发现肾脏功能损害；而后者属于有创性检查，很难被患者接受和广泛应用。近年来，DWI[1-3]、ASL[4-5]等磁共振功能成像技术被逐渐应用于临床肾脏疾病功能变化的评估。但DWI成像只能反映水分子在单方向上的扩散，不能反映水分子在各向异性的扩散情况。ASL虽然可以通过改变动脉血液的磁化状态反映组织的灌注情况，但扫描时间很难掌控，不能真实地反映DN微血管灌注情况。而扩散张量成像（DTI）可以在至少6个非共线方向上测量水分子弥散的衰减情况[6]，可以通过ADC值和部分各向异性（FA）值综合反映水分子在各个方向的扩散，更适合于弥漫性肾脏疾病功能的评价[7]。本研究拟通过对早期DN模型的DTI MRI研究，探讨Ⅰ～Ⅱ期DN肾脏功能DTI表现及与其病理的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

清洁级SD雄性大鼠20只，体质量190～280 g。采用随机数字表法将大鼠随机分成两组：实验组14只，行链脲佐菌素（STZ）腹腔注射，诱导糖尿病模型，造模后存活9只，共18个肾脏；对照组6只，给予同等剂量柠檬酸缓冲液腹腔注射，共12个肾脏。

1.2 DN大鼠模型的建立

所有大鼠禁食不禁水12 h，实验组大鼠按体质量一次性给予1%浓度链脲佐菌素溶液，按60 mg/kg的剂量腹腔注射，对照组按相同的浓度、剂量，以相同的方法一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液。造模后，两组大鼠分别单笼喂养，给予相同食水，自由摄食。3 d后，所有大鼠禁食、禁水12 h，取尾静脉血测量空腹血糖，根据糖尿病诊断标准[8-9]，若实验组大鼠造模后空腹血糖＞16.7 nmol/L，且出现明显多饮、多食、多尿、体质量减轻，即“三多一少”症状，就确定为糖尿病模型造模成功。于每日晨收集大鼠即时尿液送尿微量白蛋白（mAlb）检测，连续监测14 d；每日采集尾静脉血液测量大鼠空腹血糖。2周后，对大鼠行常规MRI及DTI扫描，扫描结束后处死大鼠，取大鼠腹主动脉血液行血清肌酐检测，取大鼠双肾，福尔马林液固定后送病理检查。DN最后诊断将综合大鼠临床、血生化及肾脏病理结果而确定,只有符合Ⅰ～Ⅱ期DN改变的纳入研究。

1.3MR成像

采用GE 3.0T磁共振仪，膝关节线圈；对实验组及对照组大鼠行MRI扫描，10%水合氯醛腹腔注射进行麻醉后取仰卧位，四肢固定。以肾脏为中心，对大鼠行常规T2WI及DTI扫描。扫描序列及参数：T2WI采用FSE-XL序列，轴位，TR 1 918ms，TE 68ms，带宽31.25 kHz/像素，频率编码288，激励次数4，视野8.0mm×8.0mm，层厚2.0mm，层间距0.2mm，扫描时间111 s；磁共振DTI采用DTI-SE序列，轴位，TR 4000ms，TE 89s，b值取0，600s/mm2，激励次数4，视野8.0mm×8.0mm，层厚2.0mm，层间距0.2mm，扫描时间260 s。

1.4 图像处理与数据分析

DTI图像数据传送至GE磁共振后处理工作站（AW4.5），由两名经验丰富的放射科医师进行盲法读片。工作站自动生成相应ADC图和FA图，避开变形及有伪影的层面，在靠近肾门水平1～2个层面，皮质和髓质分别放置3个椭圆形ROI，大小约1～3mm2，每个ROI至少5个像素。工作站在ADC图及FA图上相应位置自动生成相同的ROI，由两名医师盲法测量ADC值及FA值，记录自动生成的平均值。

1.5 病理检查

将大鼠肾脏标本用4%多聚甲醛进行固定，并脱水、切片后行HE及PAS染色，在光镜下观察切片肾小球及肾小管情况。肾脏病理分级依据Tervaet等[10]2010年提出的新的DN分期标准，Ⅰ期：肾小球基膜增厚，轻度或非特异性光镜改变；Ⅱa期：轻度系膜增生；Ⅱb期：重度系膜增生；Ⅲ期：结节性硬化；Ⅳ期：球性废弃＞50%。

1.6 统计分析

采用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验中正态计量资料用±s表示，不满足正态分布资料用“中位数±四分位间距”表示；对所有计量数据进行正态分布检验及方差齐性检验后，满足正态分布且方差齐性的资料，行组内及组间两样本比较，采用独立样本T检验，不满足正态分布的资料比较采用Mann-Whitney Test非参数检验方法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 临床、生化及病理

实验组空腹血糖较对照组明显升高，且具有明显“三多一少”症状（表1）；两组大鼠血肌酐值、尿微量白蛋白均处于正常范围，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）；对照组所有大鼠双肾病理均正常，实验组大鼠双肾组织的皮髓质清晰；18个肾脏均表现为肾小球基底膜不规则增厚，其中有11个肾脏表现为系膜轻度增生，系膜区增宽，肾小球结构萎缩，部分肾小囊呈空泡样改变；并见大量肾小管上皮细胞肿胀、脱落，肾小管管腔扩张，管壁变薄。依照最新DN分级标准[10]，实验组大鼠肾脏病理处于Ⅰ期DN改变肾脏有7个，Ⅱ期有11个（图1）。

2.2 MRI成像

2.2.1 两组DTI

表1 造模前后大鼠体质量、血糖及尿量变化情况

表2 造模后2周对照组和实验组生化结果（±s）

表2 造模后2周对照组和实验组生化结果（±s）

组别 例数 血糖（mmol/L） 肌酐（μmol/L）尿微量白蛋白（mg/L）对照组 6 5.52±0.62 30.07±6.08 4.57±2.72实验组 9 30.69±2.07 21.80±7.39 5.08±2.20 P值 0.000 0.091 0.73 t值 28.599 -1.891 -0.359

ADC图肾脏轮廓清楚，皮髓质分界清楚，皮质呈绿色，髓质呈浅绿色，两组大鼠ADC图信号从肉眼上观察未见明显差异；FA图图像清楚，皮髓质分界清楚，皮质呈深蓝色，髓质呈浅蓝色，实验组皮质颜色较对照组变浅，髓质信号差异不明显（图2）。

2.2.2 ADC值

实验组皮、髓质ADC值较对照组皮、髓质ADC值增大，两组比较有统计学意义（表3）。

2.2.3 FA值

对照组髓质FA值较皮质大，但两者比较，差异无统计学意义；实验组髓质FA值较皮质大，两者比较，差异有统计学意义；实验组皮、髓质FA值较对照组小，但两者比较，差异无统计学意义（表4）。

表3 实验组与对照组皮、髓质ADC值（×10-3mm2/s）

图1 HE染色。图1a为对照组，肾小管形态及结果未见明显变化，肾小球未见萎缩改变；图1b为实验组，白色箭头所示肾小管上皮细胞中度肿胀，上皮细胞空泡化、脱落；黑色箭头所示肾小球结构萎缩，肾小囊扩大。PAS染色。图1c为对照组，基底膜形态未见明显改变；图1d为实验组，箭头示基底膜不规则增厚，基底膜皱曲，系膜细胞轻度增生。Figure 1a,1b.The pathology of HE staining.Figure 1a:The pathology of renal in the control group was normal.Figure 1b:The pathology of experimental group.The white arrow showed that the renal tubular epithelial cells were moderate swelling and the epithelial cell was shedding.The black arrow showed that the structure of glomerular was atrophy and the renal capsule was expansion. Figure 1c,1d. The PAS staining.The basement membrane of renal in the control group was normal(Figure 1c).The arrow showed that the basement membrane was irregular thickening and wrinkling and the mesangial cell was mild hyperplasia in the experimental group(Figure 1d). Figure 2a,2b. The ADC maps of control group and experimental group.The boundary of the cortex and medulla was clear.The color of cortex was green and the medulla was light green.

图2 图2a，2b分别为对照组和实验组大鼠肾脏ADC图，皮髓质分界清楚，皮质呈绿色，髓质呈浅绿色。图2c，2d分别为对照组和实验组FA图，肾皮质与髓质分界清楚，皮质呈深蓝色，髓质呈浅蓝色；实验组皮质颜色变浅。Figure 2c,2d. The FA maps of control group and experimental group.The boundary of the cortex and medulla was clear.The color of cortex was dark blue and the medulla was light blue.The color of the experimental group was lighter than that of the control group.

表4 实验组与对照组皮、髓质FA值

3 讨论

DTI是DWI的发展和深化，不仅能反映组织内水分子的扩散幅度，还能反映各向异性的信息。b值反映DTI的扩散敏感度，低b值主要反映组织的微循环灌注，当b值增加时，组织灌注对ADC值的影响减小，高b值主要反映水分子的弥散情况[11]。DN早期，肾脏病理改变主要是肾小球结构的改变，临床主要表现为灌注的增加，此时微循环的灌注变化不明显；而b值越高，所需TE时间越长，图像信噪比增加，图像质量受到影响，因此，本研究选择b值为600 s/mm2，能很好的反映水分子的弥散，对图像质量影响也较小。

本研究结果显示，对照组大鼠临床及生化检测值均属正常，实验组存活大鼠显示典型糖尿病症状，出现多饮、多食、多尿、重量减轻的症状，但是，造模后2周所测得的血肌酐及尿微量白蛋白仍处于正常范围。此时，实验组大鼠18个肾脏病理检测结果显示肾小球及肾小管病理损伤改变，依照病理分期标准[10]， 双肾均处于Ⅰ～Ⅱ期病理改变。此时，通过MRI DTI成像，ADC图两组大鼠双肾皮髓质信号未见明显差异，而FA图显示实验组皮质信号较对照组变浅，皮髓质信号差异减小，在DN的Ⅰ～Ⅱ期，FA图信号已有所改变。Ⅰ～Ⅱ期DN在形态学及临床生化上无明显改变，但病理组织学已有改变，功能上DN大鼠处于临床高滤过期，并伴随相应的临床症状。

本实验DTI研究结果显示，实验组大鼠肾皮、髓质ADC值较对照组增大。由于实验组大鼠处于DN的Ⅰ～Ⅱ期，呈高滤过状态，肾脏病理损害程度小，组织灌注增加，故ADC值增大。与学者Xu等[12]的研究发现一致，Ⅰ期肾病肾脏ADC值与正常肾脏相比，ADC值增大。Hueper等[13-15]在慢性肾脏疾病损伤晚期的研究中发现，晚期肾病患者肾脏ADC值较正常志愿者肾脏ADC值减小。这是由于Ⅲ期以后DN的肾脏微血管损伤严重，并出现K-W结节及肾小球硬化等病理损伤，肾组织灌注明显减小，水分子扩散受到明显限制，内生肌酐清除率 （Ccr）减小，ADC值减小。

本次研究结果表明对照组肾皮质FA值较髓质小，两者比较无明显统计学差异；实验组皮质FA值较髓质小，两者间比较有统计学差异。肾皮质由肾小球和肾小管构成，肾脏水分子扩散的各向异性主要由肾小管及其周围微血管形成的屏障造成，垂直于肾小管方向的水分子扩散受到限制，平行于肾小管方向的水分子扩散更迅速[16]。本研究中实验组均为DN Ⅰ～Ⅱ期，肾小管上皮细胞肿胀、脱落及肾小管管腔扩张等病理改变使组织间隙缩小，导致水分子扩散的各向异性降低，皮质的FA值则减低，此时皮质与髓质FA值差异较大。在Lu等[7]、Hupper等[12]的研究中，肾小球滤过率减低时，糖尿病组皮髓质FA值较对照组低，而本研究实验组皮髓质FA值较对照组减小，但两者皮髓质FA值比较无差异。可能是由于实验组DN尚处于Ⅰ～Ⅱ期，两组间皮髓质FA值变化尚不大的缘故。DN早期肾脏病理损伤主要表现为肾皮质的改变，髓质病理改变不明显，此时皮髓质FA值已经出现差异，说明FA值对DN的早期诊断有一定的参考价值。

综上所述，DN处于Ⅰ～Ⅱ期时，血肌酐、尿微量白蛋白尚处于正常范围内，肾脏处于高滤过状态，皮髓质ADC值增加，DN肾皮质与髓质FA值减小，且皮质与髓质FA值之间有明显差异。可见，DTI成像技术可通过定量测量ADC值及FA值，反映DN早期肾脏功能的微观变化。由于本次研究的样本量偏小，DN的分期单一，DN的DTI研究有待深入，以进一步了解DTI对DN早期诊断及分期诊断的价值，为临床开展DN DTI早期诊断及疗效的评价提供更详实的实践及理论依据。

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A preliminary study in stageⅠ andⅡ of diabetic nephropathy rats using diffusion tensor imaging MRI at 3.0T

HU Xiao-yan1,WU Ying-hua1,GUO Liang2,KUANG Min1,WANG Fan3
(1.Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China;2.China Medical University,Shenyang 110001,China; 3.Department of Radiology,the Affiliated Hospital of Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China)

Objective:To prospectively assess the manifestation of stageⅠ andⅡ diabetic nephropathy rats using diffusion tensor imaging(DTI)MRI at 3.0T.Materials andMethods:Twenty male SD rats were randomly divided into 2 groups according to the random number table.Fourteen rats were in the experimental group,the final survival of 9 rats with 18 kidneys,and 6 rats were in the control group with 12 kidneys.The experimental group was treated with 1%streptozotocin,and the control group was given the same dose of citrate buffer solution.Two weeks later,both of the two groups of rats underwent conventional MRI and DTI examination with b value of 0 and 600 s/mm2(diffusion directions=6),and the serum creatinine and microalbuminuria were measured and the pathological change of all kidneys were examined.Mean apparent diffusion coefficient(ADC)and fractional anisotropy(FA)were determined for the cortex and the medulla by two experienced radiologists blinded.Results:The blood glucose of experimental group was significantly increased,and the serum creatinine and microalbuminuria in both of the two groups of rats were normal.The pathological changes of the kidneys in the experimental group were stageⅠ andⅡ diabetic nephropathy expression,and the control group was normal.The ADC values of cortex and medulla were increased in the experimental group compared with the control group and the difference was statistically significant(P＜0.05).In the experimental group,the difference of FA values were statistically significant between cortex and medulla (P＜0.05).While there were no significant differences in the FA values of the cortex and medulla between two groups(P＞0.05).Conclusion:The ADC value and FA value of DTI imaging maybe be more able to reflect the pathological changes than the biochemical indicator in the early stage of diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathies;Magnetic resonance imaging

R587.2；R445.2

A

1008－1062（2016）11－0795－04

2016－04－05；

2016－05－19

胡小艳（1990-），女，四川绵阳人，在读硕士研究生。E-mail：615313178@qq.com

邬颖华，成都中医药大学，610075。E-mail：wuyinghua_1111@163.com

四川省教育厅自然科学重点项目（编号：132A0285）。