H4N6 亚型禽流感病毒的进化和生物学特性分析

庄艺超，孟 飞，邓国华，施建忠，张亚萍，赵聪慧，陈化兰

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科，A 型流感病毒属，其基因组包括8 个基因节段，为一种单股负链RNA 病毒[1]。根据病毒的两种表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性不同，可将AIV 划分为16 种HA 亚型和9 种NA 亚型。此外，还有在自然界中的蝙蝠体内分离到H17N10和H18N11两种新型流感病毒[2-3]。根据AIV对禽类致病性的差异，又可将其分为高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV）两类。目前，除了绝大部分H5 亚型和部分H7 亚型AIV 属于HPAIV之外，其余病毒均为LPAIV。

自1956 年，H4 亚型AIV（A/duck/Czech Republic/1/1956（H4N6））在捷克斯洛伐克的家鸭中首次成功被分离后，在过去的几十年间，H4 亚型AIV 已经在亚洲、北美、欧洲等地广泛流行，并在野鸟、家禽以及猪等哺乳动物体内监测到[4-5]。研究发现，Bui等在日本北海道北部，已分离到不经过提前适应即可在小鼠体内有效复制的H4N8 亚型AIV，并可引起小鼠严重呼吸道疾病甚至死亡[6]。加拿大和中国也曾报道了3 例H4 亚型AIV 感染猪的病例[5,7-8]。此外，越来越多的血清学研究也显示，在中国、美国和黎巴嫩的家禽养殖场工人血清中检测出针对H4亚型AIV 的特异性抗体[8-9]。上述报道表明，H4 亚型AIV 不但在禽鸟中广泛存在，还可以感染哺乳动物和人类，因此具有非常重要的公共卫生学意义。

目前，H4 亚型AIV 在我国分布广泛，在大部分的活禽市场和个别水禽养殖场均有可能监测到该类病毒，但由于其对家禽呈现低致病力往往被人们忽视。Liang 等对2009 年～2012 年在中国活禽市场分离到的H4 亚型AIV 进行了系统研究，发现我国存在多种H4 亚型组合，不同组合的病毒进化关系不同，表现出明显的病毒异源性，说明病毒不仅在自然界中发生了复杂基因重排，还为其它亚型的AIV 提供基因供体[10-11]。此外，监测到的H4 病毒可以造成哺乳动物的感染，并在豚鼠间发生接触传播和空气传播，从而对人类健康构成潜在威胁[11]。这些发现强调了在我国持续开展H4 亚型AIV 监测的必要性。

本研究通过对2018 年在山西省家禽养殖场蛋鸡拭子样品中分离到的一株H4N6 亚型AIV，A/chicken/Shanxi/S1452/2018（H4N6）（简称CK/SX/S1452/2018）株，对其进行了全基因组测序、遗传进化分析、受体结合特性的分析，并开展了其对BALB/c 小鼠的致病性分析，进一步评估了近年来分离的H4N6 亚型AIV对哺乳动物的感染潜力，为持续开展流行病学监测和评估H4亚型AIV致人感染的风险提供了数据支撑。

1 材料与方法

1.1 病毒株及实验动物H4N6 亚型AIV（CK/SX/S1452/2018）由国家禽流感参考实验室于2018 年从山西省蛋鸡养殖场分离得到；9 日龄～11 日龄SPF 鸡胚购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；6 周龄SPF雌性BALB/c 小鼠购自北京维通利华实验动物中心。

1.2 主要试剂病毒RNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 反转录试剂盒购自日本TOYOBO 公司；EasyTaqDNA 聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒购自杭州AXYGEN 有限公司；PCR 产物回收试剂盒购自美国Omega公司；测序反应试剂盒Big Dye Terminator 3.1 和测序反应产物纯化磁珠购自美国ABI 公司；H4 亚型鸡源阳性血清由本实验室制备；96 孔板及OPD 购自Invitrogen公司；两种不同结构的糖链：SAα-2,3 Gal和SAα-2,6 Gal 由日本东京大学Yasuo Suzuki 教授惠赠。

1.3 病毒纯化及鸡胚半数感染量（EID50）的测定采用有限稀释法纯化H4N6 亚型AIV，病毒样品用含青霉素和链霉素的PBS 10 倍倍比稀释，接种于9 日龄～11 日龄SPF 鸡胚，37 ℃培养60 h 后收集血凝阳性的最高稀释度的鸡胚尿囊液，相同方法连续纯化3 代后离心分装，于-70 ℃保存备用。纯化的病毒用无菌PBS 10 倍倍比稀释后接种9 日龄～11 日龄SPF 鸡胚，每个稀释度接种5 枚鸡胚，37 ℃培养48 h 后检测各鸡胚的血凝情况，根据Reed-Muench 法计算病毒EID50。

1.4 病毒基因组测序及遗传进化分析利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，65 ℃金属浴5 min 破坏RNA二级结构，加入流感病毒反转录通用引物（12 bp，5′-AGCAAAAGCAGG-3′）将病毒基因组反转录为cDNA。在GeneBank 中下载H4 亚型AIV 基因序列，利用Hoffmann 等的引物及反应条件扩增病毒各目的片段[12]，采用DNA 纯化和胶回收试剂盒回收目的片段。按照薛振宇等人的方法测序[13]，利用DNAStar中Seqman 软件包序列分析和拼接，利用DNAStar 中Seqman 软件包进行序列分析和拼接，MEGA6.0 软件分析病毒全基因组的同源性及HA 和NA 基因的遗传进化过程。

1.5 受体结合特性试验按照Qu 等的方法采用固相结合ELISA 分析CK/SX/S1452/2018 病毒株的受体结合特性[14]。将病毒尿囊液用β-丙内酯灭活后，24 000 r/min 4 ℃超离浓缩2 h 并配制成64 单位病毒抗原。将初始浓度为100 ng/μL 的α-2,3 和α-2,6 糖链加入ELISA 酶标板中，100 μL/孔，2 倍倍比稀释11 次后，置于254 nm 紫外光下交联10 min，预冷的PBS 洗涤4 次后按100 μL/孔加入64 单位灭活病毒，4 ℃孵育8 h～10 h；弃去液体后用预冷的PBST（含1%的Tween20）洗4次，PBS洗1次；每孔加入100 μL 福尔马林溶液以去除NA 活性。室温放置30 min 后用相同方法洗涤；以针对该病毒株的鸡源阳性血清（1∶600）作为一抗，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h 后以相同方法洗涤；兔抗鸡IgG-HRP（1∶1500）作为二抗，每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h 后洗涤；以100 μL/孔避光加入OPD 显色液，以50 μL/孔加入0.5 mol/L 硫酸终止显色，490 nm 处读取吸光值。利用GraphPad Prism 5 软件分析结果并绘制曲线图。

1.6 小鼠致病性试验参照文献[11]方法，将8 只6周龄SPF 雌性BALB/c 小鼠经CO2吸入麻醉后，以106EID50/50 μL 剂量经鼻腔感染病毒，同时设立PBS阴性对照组。感染后第3 d 随机迫杀3 只小鼠并采集鼻甲、肺脏、脾脏、肾脏和脑，通过鸡胚滴定法检测病毒在小鼠各脏器中的复制情况；剩余5 只小鼠每天记录体质量变化并观察其临床症状至感染后第14 d。

2 结 果

2.1 病毒的遗传进化分析结果

2.1.1 病毒基因组核苷酸相似性分析 对CK/SX/S1452/2018 病毒株进行全基因组测序，通过NCBI 数据库Blast进行序列相似性分析比对，最终获得与该病毒株各基因节段核苷酸同源性最高的病毒株（表1）。结果显示，该病毒株各基因节段来源复杂，其中表面基因HA 和NA 均来源于H4N6 亚型AIV A/duck/Mongolia/543/2015（H4N6）株，与CK/SX/S1452/2018病毒株HA 和NA 基因的同源性最高，分别为99.23%和99.22%，但发现其与国内近年来监测到的家禽源H4 亚型AIV 核苷酸相似性较低；内部基因主要来源于鸭或水鸟体内分离的H3N3、H4N8、H3N8、H2N8 和H7N3 等亚型AIV，与之相对应基因的同源性高达98.38%～99.90%。对比还发现，其各基因节段同源性最高的病毒株均属欧亚谱系，且与我国周边各国鸭体内分离病毒株各基因的核苷酸同源性最高，因此CK/SX/S1452/2018 病毒株的基因来源可能为野鸟。

表1 与CK/SX/S1452/2018株8个基因节段同源性最高的病毒株Table 1 The virus strains with the highest homology with CK/SX/S1452/2018

2.1.2 HA 基因序列分析及遗传进化分析 CK/SX/S1452/2018 病毒株HA 基因的编码区全长为1 695 nt，编码564 个氨基酸，HA 基因裂解位点的氨基酸基序为338PEKASR↓GLF，有且仅有一个碱性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征。HA 蛋白具有5 个潜在的N-糖基化位点，其中4 个位于HA1 亚基，分是18NYT20、别34NGT36、178NLT180和310NIS312，另外1 个497NGT499位于HA2 亚基。病毒HA 蛋白相关受体结合位点比较保守，并未进一步获得结合人型受体的226L 和228S 突变（H3 numbering），但出现了160A 的突变，可以初步推测该H4N6 亚型AIV 同时具备感染家禽和哺乳动物的能力[15]。遗传进化分析结果显示，该病毒株HA基因属于欧亚分支，但与近期在我国监测到的家禽源H4 亚型AIV 株HA 基因遗传进化关系较远，核苷酸同源性为93.9%～96.2%；但与野鸟源H4 亚型AIV株HA 基因遗传关系较近（图1），核苷酸同源性为94.7%～99.2%。上述结果表明，本研究的H4N6 亚型AIV 株HA 基因可能来源于鸭或野鸟H4N6 亚型AIV。

图1 分离病毒HA基因的遗传进化树Fig.1 The phylogenetic tree of HA gene

2.1.3 NA 基因序列分析及遗传进化分析 CK/SX/S1452/2018 病毒株NA 基因编码区全长为1 410 nt，编码469 个氨基酸，未发现NA 蛋白茎区发生氨基酸缺失，但存在5 个潜在的糖基化位点：54NST56、67NFT69、70NIT72、86NLT88、146NGT148和402NWS404。NA 特异性氨基酸位点分析发现，与神经氨酸酶耐药性相关位点119E、222I、246A 和292R 仍较保守，未发生突变，初步推测该H4N6 亚型AIV 未出现对神经氨酸酶相关拮抗剂的耐药性。病毒株NA 基因在遗传进化关系上仍属欧亚分支，但与近期在我国监测到的家禽源H4 亚型AIV 株NA 基因遗传进化关系较远，核苷酸同源性为90.6%～91.4%；与野鸟源H4 亚型AIV 株NA 基因遗传关系较近（图2），核苷酸同源性为97.5%～99.2%。上述结果表明，本研究的H4N6 亚型AIV 株NA 基因也同样可能来源于鸭或野鸟H4N6亚型AIV。

图2 分离病毒NA基因的遗传进化树Fig.2 The phylogenetic tree of NA gene

2.1.4 内部基因序列分析及遗传进化分析 6 个内部基因序列分析结果显示，CK/SX/S1452/2018 病毒株PB2 蛋白氨基酸序列aa271、aa627 和aa701 均未发生T271A、E627K 或D701N 对哺乳动物致病力增强的突变。其他内部基因也未发现存在增强病毒对哺乳动物致病力的关键氨基酸位点的突变。表明该H4N6亚型AIV 株内部的基因进化仍比较保守，病毒一直在禽类中流行和循环，并未经过哺乳动物体内适应的过程。遗传进化分析结果显示，其内部基因均属于欧亚分支，且与国内近年监测到的H4 亚型AIV 核苷酸亲缘关系较远（表1）。推测该病毒内部基因最初可能来源于野生鸟类携带的AIV。an

2.2 受体结合特性试验结果以往的研究发现，病毒HA 蛋白与唾液酸受体结合能力取决于病毒HA 基因受体结合位点的氨基酸基序，它决定着病毒是否能够感染家禽或哺乳动物。在本研究中，分析结果显示，其相关受体结合位点虽然并未获得226L 和228S突变（H3 numbering），但病毒株出现了T160A 的突变，可能影响其与人型受体的结合能力[16]。采用固相结合ELISA 分析了CK/SX/S1452/2018 病毒株的受体结合特性，发现其与两种唾液酸受体均可结合，但其结合禽型α-2,3 唾液酸受体和人型α-2,6 唾液酸受体的能力要强于结合禽型α-2,6 唾液酸受体的能力（图3）。上述试验结果表明，CK/SX/S1452/2018 病毒株同时具备感染家禽和哺乳动物的潜力。

图3 病毒株CK/SX/S1452/2018唾液酸受体结合特性分析Fig.3 Receptor-binding property of CK/SX/S1452/2018

2.3 病毒对BALB/c 小鼠的感染性试验将病毒株以106EID50/50 μL/只剂量鼻腔感染8 只SPF 雌性BALB/c 小鼠，感染后3 d 随机迫杀3 只小鼠，取其脏器进行病毒含量滴定。结果显示，该病毒株可未经预先适应即可直接感染小鼠，并可在小鼠鼻甲和肺脏中有效复制，病毒滴度分别为2.8 log10EID50/mL和4.2 log10EID50/mL，但未在小鼠的脑、脾和肾中检测到病毒的复制（图4）。其余的5 只小鼠经14 d 连续观察，并未发现较为明显的临床症状，体质量在14 d观察期内与对照组小鼠无明显差异（图5）。结果表明，CK/SX/S1452/2018 病毒株对小鼠呈低致病力，为一过性感染。

图4 感染后3 d病毒株在BALB/c小鼠脏器中的复制情况Fig.4 Viral titers in the organs of BALB/c mice at 3 d post-inoculation

图5 病毒感染BALB/c小鼠后的体质量变化Fig.5 Body weight of mice post-inoculation

3 讨 论

在自然界，H1N1、H2N2 和H3N2 亚型流感病毒已导致4 次人类流感大流行，目前H1N1 和H3N2 亚型流感病毒仍在人类中活跃传播。H5 和H7 亚型HPAIV 经常在家禽和野鸟中引起严重的疾病暴发。在过去20 年里，H5 亚型AIV 不仅对家禽养殖业造成重大危害，而且还在多个国家引起了严重的人类感染和死亡[17]。2013 年在中国出现的H7N9 病毒在2017 年突变为高致病性病毒株后，不仅在中国多个省份引起鸡的流感疫情暴发，而且进一步增强了其对人类的危害[18-19]。

LPAIV 通常不会在动物中引起疾病或死亡，这使其在动物疾病的控制中易被忽视，在自然界悄然进化，但它们的流行和蔓延有时也会严重影响家禽的生产效率，也会对人类健康构成威胁。2013 年的H7N9 亚型LPAIV 虽然对家禽不致病，但也曾在我国致大量人的感染和死亡[18]。H9N2 亚型LPAIV 不仅可在雪貂中飞沫传播，而且在多个国家出现人感染的病例报道[20]。此外，携带不同NA基因的H10亚型AIV在不同国家也引起人类的感染。说明这些LPAIV 同样具有重要的公共卫生学意义。

H4 亚型AIV 除可感染禽鸟外，还可感染猪、海豹和小鼠等哺乳动物，近年来也获得不少感染人的血清学和病原学证据[8-9]。在国家禽流感参考实验室近年来的流行病学监测中，发现H4 亚型AIV 在我国的活禽市场和部分水禽养殖场中存在一定的流行，进一步的遗传进化分析结果说明湖区水域放养的水禽与野生水鸟类等存在着AIV 的相互传播。突出了H4 亚型LPAIV 潜在的传播风险以及监测禽类和其他动物H4 亚型AIV 的重要性。

本研究发现2018 年自山西家禽养殖场蛋鸡拭子样品中分离的CK/SX/S1452/2018 是一株野鸟源重组病毒。野鸟作为AIV 许多亚型的自然储存宿主，在流感病毒的进化和传播过程中发挥着重要作用，病毒随着候鸟的迁徙路线传播扩散。与Liang 等在2009 年～2012 年分离到的H4 亚型AIV 相比，该病毒株HA 裂解位点基因基序仍保持低致病性病毒株特征[11]。对与哺乳动物致病力增强、哺乳动物间传播能力增强等相关的特异性关键氨基酸位点的比对，发现CK/SX/S1452/2018 病毒株与2009 年～2012 年的病毒株在这些位点基本一致，说明分离的这株病毒仍具备在禽类中传播、流行、遗传进化相对保守的特点。但受体结合特性试验发现，CK/SX/S1452/2018 病毒株同样具有结合人型唾液酸受体的能力，即可同时结合人型和禽型唾液酸受体，但受体结合特性试验发现，CK/SX/S1452/2018 病毒株同样具有结合人型唾液酸受体的能力，即可同时结合禽型α-2,3和人型α-2,6两种唾液酸受体的能力，进一步提示了对H4 亚型AIV 感染防控的公共卫生学意义。因此，应当加强对如H4亚型AIV等LPAIV的监测力度，关注其对哺乳动物致病力的变化，防止其对人类公共卫生安全造成严重破坏。