效应蛋白Rhs 对鼠伤寒沙门菌生物学特性影响的研究

董 震，王志林，陈启伟，吴锦艳，尚佑军，刘永生，杨世华，兰 喜*

（1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730046；3.甘肃省定西市安定区畜牧兽医局，甘肃 定西 743000）

沙门菌属（Salmonella）是一群寄生在人类和动物体内，引起肠道系统疾病的革兰阴性杆菌[1]。鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）是沙门菌属多价O抗血清的B 群，是一种兼性细胞内寄生病原体，广泛分布于自然界，大小0.6 μm～1.0 μm×2 μm～4 μm，有菌毛、无荚膜、无芽孢，多引起胃肠炎，是重要的人兽共患病病原菌[2]。因此，对鼠伤寒沙门菌开展研究具有重要的公共卫生意义。

自然界中一些致病菌为了能在宿主体内生存、增殖和扩散，必须分泌一些毒力因子，而一些非致病菌为了适应其生活环境，也向外分泌一些蛋白质，使细菌与外界进行能量物质交换或是与其他细菌进行信息传递。细菌依赖分泌通路进行蛋白质跨胞浆膜转运的系统称为分泌系统[3]。目前已经发现9种细菌分泌系统[4]。VI 型分泌系统（Type VI secretion system，T6SS）是一种接触依赖性分泌系统，类似于噬菌体的尾部结构，细菌将产生的效应因子通过该结构分泌到细菌胞外[5]。T6SS 有很多功能，例如能增强致病菌与其它细菌间的竞争力，增加致病菌的毒力等[6]。

Rhs（Rearrangement hotspot）基因在大肠杆菌K-12 型菌株中首次被发现，该基因最初被认为是细菌发生基因重组的一个热点区域，并以此命名[7]。在伤寒沙门菌中Rhs 由核心rhs基因和与之相邻的孤立rhs基因两部分构成[8-9]，核心rhs基因与沙门菌毒力岛（Salmonella pathogenicity island，SPI）编码T6SS 的基因相邻，沙门菌SPI 编码不同的调控蛋白，在其感染的过程中发挥重要调控作用[10]。 Rhs 蛋白是革兰氏阴性肠杆菌通过T6SS 分泌的毒性效应因子[11]。研究发现，细菌Rhs 蛋白通常携带毒素结构域，提示该蛋白可能与细菌的致病力相关[12]。革兰氏阴性菌的Rhs 蛋白参与介导细菌之间为了生长而争夺有限营养或空间的竞争[13]。但鼠伤寒沙门菌未见相关研究，为了研究鼠伤寒沙门菌效应分子Rhs 的功能，本研究构建鼠伤寒沙门菌CVCC541 株的rhs1、rhs2基因缺失株及回补株，比较分析效应分子Rhs 对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病力的影响，从而为研究该基因在细菌致病机制中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及细胞鼠伤寒沙门菌株CVCC541，质粒pKD46、 pKD4 和pCP20、Hela 细胞、小鼠巨噬细胞RAW264.7 细胞均由实验室保存。

1.2 主要试剂OMEGA 质粒提取试剂盒购自Omega公司；高保真酶PrimeSTAR®Max DNA Polymerase、DNA 凝胶回收试剂盒、DL5000 DNA Marker 购自Ta-KaRa 公司；限制性内切酶DpnI 购自美国Promega公司；L-（+）阿拉伯糖购自生工生物工程（上海）有限公司；Fetal bovine serum（FBS）、培养液DMEM、0.25% Trypsin-EDTA (胰酶）均购自美国Gibco 公司；Triton X-100 购自Sangon 公司；雌性6 周龄体质量18 g～20 g SPF 级昆明（KM）小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。

1.3 引物的设计与合成根据NCBI 鼠伤寒沙门菌14028S 基因组序列（CP001363.1），分析rhs1基因（STM14_0340）、rhs2基因（STM14_0341）位置，设计敲除引物Rhs1-qcF/R 和Rhs2-qcF/R，鉴定缺失菌株引物Rhs1-jdF/R 和Rhs2-jdF/R，以及一对卡那霉素抗性基因引物Kan-F/R，用于构建回补株的引物Rhs1-EcoR I-F/Rhs1-HindIII-R 和Rhs2-EcoR I-F/Rhs2-HindIII-R，鉴定回补株引物pSTV28-F/R（表1）。引物均由西安擎科泽西生物科技有限责任公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.4 rhs1和rhs2基因缺失株的构建与鉴定为了获得rhs1和rhs2同源DNA 片段，分别以Rhs1-qcF/R、Rhs2-qcF/R 为引物，质粒pKD4 作为模板。经PCR分别扩增含上、 下游同源臂及卡那霉素抗性基因的片段rhs1-pKD4、rhs2-pKD4。将pKD46 质粒经电转化至伤寒沙门菌CVCC541 感受态细胞中，筛选获得重组菌pKD46/CVCC541，将重组菌振荡培养OD600nm值为0.2 时，加终浓度为30 mmol/L 的L-（+）阿拉伯糖，诱导至OD600nm≈0.6，制备成感受态细胞。将扩增得到的rhs1-pKD4 和rhs2-pKD4 基因片段分别电击转化入pKD46/ CVCC541 感受态细胞，以同源重组替换rhs1和rhs2基因，构建Δrhs1∷kan和Δrhs2∷kan，并分别利用两对鉴定rhs1的引物Rhs1-jdF/Kan-R、Kan-F/Rhs1-jdR，和两对鉴定rhs2的引物Rhs2-jdF/Kan-R、Kan-F/Rhs2-jdR 进行PCR 鉴定。取上一步鉴定正确的重组菌株Δrhs1∷kan 和Δrhs2∷kan，制备感受态细胞，并将pCP20 质粒电击转化入该感受态细胞内，42 ℃，振荡培养。获得基因缺失菌株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2，利用相应引物进行PCR 鉴定，PCR 产物由西安擎科泽西生物科技有限责任公司测序。

1.5 rhs1和rhs2基因回补株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的构建以鼠伤寒沙门菌CVCC541基因组DNA 作为模板，以Rhs1-EcoR I-F/Rhs1-Hind III-R 和Rhs2-EcoR I-F/Rhs2-Hind III-R 为引物，利用PCR 分别扩增包含启动子及开放阅读框（ORF）的EcoR I-rhs1-Hind III 、EcoR I-rhs2-Hind III 回补基因片段，将扩增产物酶切纯化后克隆至pSTV28表达质粒中，构建回补质粒pSTV28-rhs1和pSTV28-rhs2，将其分别电转入基因缺失株感受态细胞CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2，通过氯霉素抗性筛选得到回补菌株C-Δrhs1、C-Δrhs2，采用引物pSTV28-F/R 经PCR 鉴定并测序鉴定。

1.6 缺失株的体外遗传稳定性试验参照文献[14]的研究方法，将得到的基因缺失菌株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2，以及亲本株在无抗LB 平皿上划线传代培养，并分别在第5、10、15、20、25 和30代，挑取单菌落，利用鉴定引物经PCR 鉴定基因缺失株的遗传稳定性。

1.7 细菌的生长曲线测定分别挑取亲本株、基因缺失株和回补株的单菌落，37 ℃、180 r/min 振荡培养17 h 后取各菌液100 倍稀释后，37 ℃振荡培养，每隔1 h 测定OD600nm，共测定17 h，并以无菌LB 培养基为空白对照测定OD600nm，每个时间点的菌液重复测定3次，取其平均值绘制生长曲线，完整试验重复3次。

1.8 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2黏附Hela 细胞试验按参考文献[15]方法，将Hela 细胞以4×105个/孔，接种于24 孔细胞培养板中，待Hela 细胞长成单层后，设置三个平行孔并于黏附试验开始前1 h 换DMEM培养。将亲本株CVCC541、缺失株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2、回补株C-Δrhs1和C-Δrhs2培养至OD600nm≈0.7，离心菌液收集菌体并用DMEM 培养基将菌液调整为感染复数（MOI）为10 的悬液，接种1 mL/孔，分别感染Hela 细胞，置于37 ℃，5%的CO2培养3 h。弃培养基，用PBS 清洗，加入1 mL/孔0.25%的Trypsin-EDTA（胰酶）消化，取100 μL 悬液，10 倍倍比稀释，涂布于LB 平皿并菌落计数，整个试验重复3 次。细菌黏附率计算公式：黏附率=（黏附的细菌数cfu/最初接种细菌数cfu）×100%。

1.9 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2侵袭Hela 细胞试验各菌株感染细胞的方法与1.8 黏附试验相同。参照文献[16]方法，细菌感染细胞培养3 h 后弃去培养基，用PBS 清洗，每孔加入1 mL 含庆大霉素（300 μg/mL）的DMEM 培养基，继续培养1 h 后弃去培养基，用PBS 清洗细胞表面，每孔加入1 mL含浓度为1% Triton X-100 的PBS，吹打使细胞脱落裂解，取100 μL 悬液10 倍倍比稀释后涂布于LB 平皿，37 ℃培养记录菌落个数，整个试验重复3 次。细菌侵袭率计算公式：侵袭率=（庆大霉素处理得到的细菌数cfu/最初接种细菌数cfu）×100%。

1.10 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2在巨噬细胞内存活试验以每孔约5.4×105个RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板中，参照1.8 方法以各菌株感染RAW264.7细胞，后续试验方法同1.9，试验重复3 次。计算吞噬的细菌比例，吞噬后细菌存活率=（被吞噬后存活的细菌数量cfu/加入的细菌数量cfu）×100%。

1.11 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541 Δrhs2、C-Δrhs1 和C-Δrhs2 对小鼠半数致死量（LD50）测定将120 只6 周龄的SPF 级昆明鼠随机分为I、II、III、IV、V 5 个大组，每大组24 只，分别接种CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2，再将各大组分4 个剂量组，每组6 只，同时设定3 只小鼠的对照组，将细菌培养到OD600nm为0.8，离心收集菌体，用PBS 重悬并将OD600nm值调整至1，做10 倍倍比稀释，分别取10-5、10-6、10-73 个稀释度的菌液各0.1 mL 涂布于LB 培养皿中，37 ℃过夜培养，次日菌落计数以计算实际感染量。其中4 个不同剂量组分别腹腔注射0.2 mL 的100、10-1、10-2、10-3不同稀释度的菌液，对照组经腹腔注射0.2 mL 无菌PBS，接种后小鼠在同等环境下隔离饲喂，12 h 观察一次，连续观察7 d 并记录，结果采用寇氏法（Karber）计算LD50[17]。

1.12 统计方法 黏附、侵袭及吞噬后存活试验数据均采用SPSS11.5 软件进行分析，各组间差异比较采用t检验，P＜0.05 或P＜0.01 为差异具有统计学意义，用GraphPad Prism 5.0 软件制图。

2 结 果

2.1 rhs1与rhs2缺失株的构建及鉴定结果为了获得含有卡那霉素抗性基因且带rhs1、rhs2同源臂的片段。以pKD4 质粒为模板利用Rhs1-qcF/R 和Rhs2-qcF/R 两对引物进行PCR 扩增，结果显示，PCR 分别扩增出1 567 bp 的DNA 片段（图1），与预期片段大小相符，表明已获得带有rhs1和rhs2同源臂的卡那霉素抗性基因片段rhs1-pKD4、rhs2-pKD4。将同源片段rhs1-pKD4 和rhs2-pKD4 分别电转入到含pKD46/CVCC541 的菌株，并以该菌株为模板，利用引物Rhs1-jdF/Kan-R，Kan-F/Rhs1-jdR 和Rhs2-jdF/Kan-R，Kan-F/Rhs2-jdR 对其进行PCR 交叉鉴定，结果显示，卡那霉素基因已替换rhs1基因，扩增的片段大小为1 172 bp 和1 351 bp；卡那霉素基因已替换rhs2基因，扩增大小为1 570 bp 和1 448 bp（图1），与理论值吻合。测序结果显示，rhs1、rhs2基因同源区内序列已被卡那霉素抗性基因取代，并将新菌株命名为Δrhs1∷kan 和Δrhs2∷kan。

将pCP20质粒电转入Δrhs1∷kan 和Δrhs2∷kan 菌株制成的感受态细胞内，以筛选后得到的菌株经PCR 鉴定结果显示，分别扩增出535 bp 和1 131 bp 的DNA 片段（图1），与理论值相符；测序结果也显示目的基因被敲除，将新菌株分别命名为CVCC541 Δrhs1、CVCC541Δrhs2。

图1 基因缺失菌株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的PCR鉴定结果Fig.1 Identification of gene deletion strains CVCC541Δrhs1 and CVCC541Δrhs2 by PCR

2.2 rhs1和rhs2基因回补株C-Δrhs1和C-Δrhs2的构建及鉴定结果为了构建基因缺失回补株，将构建的回补质粒pSTV28-rhs1 和pSTV28-rhs2电转入基因缺失株感受态细胞CVCC541Δrhs1和CVCC541 Δrhs2中，分别利用鉴定引物pSTV28-F/R 进行PCR鉴定，结果显示，PCR 扩增片段分别为5 971 bp 和2 719 bp（图2），均与理论值一致，测序结果显示，回补质粒已被导入缺失株中。表明正确构建了rhs1基因回补株C-Δrhs1和rhs2基因回补株C-Δrhs2。

图2 基因回补菌株C-Δrhs1与C-Δrhs2的PCR鉴定结果Fig.2 Identification of gene complement strains C-Δrhs1 and C-Δrhs2 by PCR

2.3 缺失菌株体外遗传稳定性试验结果通过对基因缺失菌株的体外连续传代培养，取5～30代缺失株单菌落，分别采用鉴定引物Rhs1-jdF/R和Rhs2-jdF/R进行PCR 鉴定，结果显示均可扩增出535 bp 和1 131 bp 的目的片段，亲本株扩增出4 316 bp 和1 855 bp 的目的片段（图3）。表明基因缺失菌株在体外传代能够稳定遗传。

图3 缺失菌株体外遗传稳定性的PCR鉴定结果Fig.3 Identification of genetic stability of the deletion strains in vitro by PCR

2.4 细菌的生长曲线测定结果在不同培养时间分别测定鼠伤寒沙门菌亲本株、缺失株、回补株悬液的OD600nm值，绘制细菌生长曲线，从生长曲线图可见培养17 h 期间，0～2 h 为迟缓期、3 h～8 h 为对数期、9 h～13 h 为稳定期、14 h～17 h 为衰亡期，缺失株、回补株与亲本株CVCC541 相比生长曲线无明显差异（图4）。表明Rhs1 和Rhs2 效应因子的缺失不影响鼠伤寒沙门菌的生长特性。

图4 亲本株、缺失株、回补株的生长曲线Fig.4 Growth curve of the wildtype,mutants and complement strain

2.5 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2黏附Hela 细胞试验结果本试验用Hela 细胞作为细胞模型来比较亲本株CVCC541 与缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2及回补株C-Δrhs1、C-Δrhs2对细胞黏附能力的差异。结果显示，CVCC541 的黏附率为5.213%±0.3744，缺失株CVCC541Δrhs1的黏附率为8.03%±0.9708，缺失株CVCC541Δrhs2的黏附率为8.91%±1.478，回补株C-Δrhs1和C-Δrhs2的黏附率分别为6.543%±0.6835（P＞0.05），5.017%±0.1997。缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和回补株C-Δrhs1、C-Δrhs2的黏附能力与亲本株相比均无明显差异（P＞0.05）（图5）。表明Rhs1 与Rhs2 效应因子的缺失不会影响鼠伤寒沙门菌对Hela 细胞的黏附能力。

图5 亲本株、缺失株、回补株对Hela 细胞黏附率的比较Fig.5 Comparison of adhesion rate of the wildtype,mutants and complement strains to HeLa cells

2.6 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541-Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2侵袭Hela 细胞试验结果Hela 细胞模型中亲本株与基因缺失株，回补株侵袭率结果显示，亲本株CVCC541 的侵袭率为0.2295%±0.09785，缺失株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的侵袭率分别为1.144%±0.2308、0.7897%±0.1485，回补株CΔrhs1和C-Δrhs2的侵袭率为0.6320%±0.1371（P＞0.05）、0.4803% ± 0.08939。 与亲本株相比， 缺失株CVCC541Δrhs1和CVCC541Δrhs2的侵袭能力差异显著（P＜0.05），且分别提高了4.9倍和3.4倍，回补株CΔrhs1和C-Δrhs2与亲本株的侵袭力相比较无明显差异（P＞0.05）（图6）。表明Rhs1、Rhs2 效应因子的缺失会增强鼠伤寒沙门菌侵袭细胞的能力。

图6 亲本株、缺失株、回补株对Hela细胞侵袭率的比较Fig.6 Comparison of invasion rate of the wildtype,mutants and complement strains to HeLa cells

2.7 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、C-Δrhs1和C-Δrhs2在巨噬细胞内存活试验结果比较亲本株CVCC541、基因缺失株CVCC541 Δrhs1、CVCC541Δrhs2和基因回补株C-Δrhs1、C-Δrhs2在巨噬细胞内的存活能力。结果显示，CVCC541 被巨噬细胞吞噬后存活率为0.817%±0.1116，缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2吞噬后存活率分别为6.447%±0.4324%、4.86%±0.3787%；回补株C-Δrhs1和C-Δrhs2的吞噬后存活率分别为4.220%±0.5372、3.717%±0.3718（图7）。相对于亲本株CVCC541，缺失株CVCC541Δrhs1与CVCC541Δrhs2被吞噬后存活力分别上升了7.8 倍和5.9 倍（P＜0.01），而回补株的基因功能部分恢复（P＜0.05）。结果表明，Rhs1 和Rhs2效应因子的缺失提高了鼠伤寒沙门菌在巨噬细胞内的生存能力。

图7 亲本株、缺失株、回补株被吞噬后的存活能力Fig.7 Survival rate of the wildtype,mutants and complement strains in phagocytic

2.8 菌株CVCC541、CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2、对小鼠LD50测定结果亲本株CVCC541、基因缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2和基因回补株C-Δrhs1、C-Δrhs2经腹腔注射感染小鼠，测定各菌株的LD50。对小鼠致病性结果显示，亲本株CVCC541对小鼠的死亡率为70.8%，LD50为2.53×106cfu/mL；缺失株CVCC541Δrhs1对小鼠的死亡率为50%，LD50为1.31×107cfu/mL；缺失株CVCC541Δrhs2对小鼠的死亡率为58.3%，LD50为5.40×106cfu/mL；回补株C-Δrhs1对小鼠的死亡率为62.5%，LD50为3.82×106cfu/mL；回补株C-Δrhs2的死亡率为62.5%，LD50为4.67×106cfu/mL。缺失株CVCC541Δrhs1、CVCC541Δrhs2与亲本株CVCC-541 相比LD50分别下降了5.2 倍和2.1 倍，而回补株的毒力部分恢复。结果表明，鼠伤寒沙门菌Rhs1 和Rhs2 效应因子的缺失会降低细菌的致病力使细菌的毒力下降。

3 讨 论

研究细菌与宿主之间的相互作用对于细菌生理学和改进细菌感染治疗方案具有重要意义。为了更深入了解鼠伤寒沙门菌效应因Rhs 在感染与致病过程中发挥的生物学功能，本研究利用Red 同源重组技术构建了伤寒沙门菌rhs基因缺失株和回补株，通过测定亲本株、缺失株、回补株的生物学特性，初步评价了效应因子Rhs 在鼠伤寒沙门菌感染和致病过程中发挥的作用。试验结果表明，缺失株经过多次传代培养后遗传特性稳定；rhs基因的缺失对鼠伤寒沙门菌的体外生长和黏附细胞的能力无明显影响，而侵袭细胞能力和存活能力显著的上升；通过构建小鼠感染模型进行毒力的比较，rhs基因的缺失导致细菌毒力减弱，进而降低了对小鼠的致死率。这说明效应因子Rhs 对鼠伤寒沙门菌在细胞内生存和致病的过程发挥着重要作用，可能是决定细菌在宿主机体内定居、增殖、扩散以及致病的重要因子之一。

本实验敲除了鼠伤寒沙门菌rhs基因导致细菌在细胞的侵袭能力和存活能力均增强，这种现象与小鼠致病性试验结果似乎矛盾。正常情况，缺失rhs基因的细菌在宿主细胞内增殖加速，可能意味着细菌毒力的增强，然而这与本实验结果相反。推测原因可能是由于效应因子Rhs 具有II 型毒素-抗毒素（Toxin-Antititoxin，T-A）系统中的毒素功能。抗毒素容易被应激诱导产生的蛋白酶LON 降解[18-19]。有研究鼠伤寒沙门氏菌进入巨噬细胞后LON 表达上调[20]，表明在这种情况下抗毒素被加速降解，因为细菌缺乏足够水平的抗毒素，所以会导致具有Rhs T-A 系统的细菌毒素水平上升停止生长，相反缺乏T-A 系统的突变株生长受限较小，进而使鼠伤寒沙门氏菌rhs基因缺失株比亲本株在细胞内的增殖速度更快。本研究团队将进一步实验验证上述推论。

另外有研究表明，Rhs 蛋白毒素杀伤不具有选择性，同时铜绿假单胞菌中的rhs基因能编码一种针对哺乳动物的毒力因子可以调节宿主的炎症反应，伯氏嗜线虫致病杆菌的rhs基因可以编码一种对线虫有毒的蛋白质[21]，敲除rhs基因的鼠伤寒沙门氏菌SL1344 突变株在感染猪和牛的试验中毒力减弱[22]。Yu 等发现核盘菌的Ss-Rhs1 是一种分泌型Rhs重复蛋白它对细菌的毒力至关重要[23]。这些实验结果也印证了本研究小鼠半数致死量试验得出的关于效应因子Rhs 在细菌致病机制中发挥重要作用的结论。可见Rhs 毒素确实是鼠伤寒沙门菌的毒力因子之一，rhs基因的缺失造成了Rhs 毒素的减少可导致细菌对宿主的毒力降低。。

本研究通过对伤寒沙门菌rhs1和rhs2基因生物学特性的探究，一定程度上首次证实了效应因子Rhs 参与了伤寒沙门菌在细胞内的增殖和存活能力，同时也表明了该基因与宿主被感染后致病力有密切关系，为深入研究该基因在细菌感染及致病宿主机体的过程中提供了见解。