广东地区羊源凝固酶阴性葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析

罗静龙，张凯川，贾荣荣，陈柳妃，贾 坤*

（1.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642；2.广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室，广东 广州 510642；3.广东省宠物工程技术研究中心，广东 广州 510642）

葡萄球菌可分为凝固酶阳性葡萄球菌（Coagulase-positiveStaphylococcus，CPS）和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS），其中CNS 包括松鼠葡萄球菌、表皮葡萄球菌或腐生葡萄球菌等，它们通常定居在人类和动物的皮肤或粘膜上，是一种重要的条件性致病菌[1]。CNS 是临床导致奶牛乳房炎的重要病原之一，常对畜牧业造成重大经济损失[2]。CNS 是甲氧西林耐药基因（mecA）的储存库，该基因位于一种称为葡萄球菌盒式染色体的可移动遗传元件上，通过编码青霉素结合蛋白获得甲氧西林抗性，使大多数β-内酰胺类抗生素完全失活。据报道，mecA基因可以在CNS 中进化，并水平转移到其他易感的葡萄球菌中[3]。CNS 主要通过改变药物的靶向位点、酶的失活、降低细胞膜的通透性以及外排泵获得对抗生素的耐药性[4]。耐药菌株的不断出现对动物健康及食品安全造成了巨大威胁，已报道在牲畜、肉末和散装罐奶[3]、奶牛乳房炎[5]、零售鸡肉[6]以及即食食品[7]中分离出多重耐药的CNS。由于具有普遍的多重耐药性以及难以预测的流行病学风险，并可能从动物传播给人类，CNS 已成为具有重要临床意义的病原菌。

呼吸道疾病是羊养殖中最常发生的疾病之一，占小反刍动物疾病总数的5.6%。近年来，随着广东养羊业的发展，许多规模化羊场的呼吸道疾病发病率也明显上升，对广东养羊业造成了严重的经济损失。本研究以广东各地采集的279 份羊鼻拭子样品为研究对象，通过分离鉴定、药敏试验以及耐药基因的检测，对广东地区羊源CNS 进行研究，为广东省羊呼吸道疾病的防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料2018 年～2020 年本研究室分别从广东省湛江、阳江、肇庆、梅州、河源5 个市的不同规模化养殖场采集有呼吸道疾病的羊鼻拭子样品146 份、74 份、35 份、18 份、6 份，合计279份。患病羊精神沉郁，喜卧，咳嗽、流粘液性或脓性鼻液，部分羊流泪，眼分泌物增多，严重者表现为呼吸困难，且为腹式呼吸。

3 周龄昆明系小鼠由南方医科大学实验动物中心提供。LB 肉汤、LB 营养琼脂、甘露醇氯化钠琼脂培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；高纯度低电渗琼脂糖购自北京擎科新业生物技术有限公司；2×TaqPCR StarMix with Loading Dye、Sterile ddH2O 购自北京康润诚业生物科技有限公司；Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司；F-DH5α 快速转化感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；快速革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 病原菌的分离及形态学观察将采集的279 份鼻拭子样品分别置于1 mL 灭菌LB 营养肉汤中，37 ℃培养24 h 增菌。将过夜培养物接种于5%绵羊血平板，37 ℃培养24 h，观察菌落形态，挑取优势菌落进行纯培养。将纯化后的菌株接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基进行选择培养，挑取单菌落至玻片上经革兰氏染色，于显微镜下观察。

1.3 分离菌16S rRNA 的PCR 扩增及序列分析利用16S rRNA 基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′/1492R： 5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′），引物由天一辉远生物科技有限公司合成。提取各分离株基因组DNA 作为模板进行PCR 扩增，反应条件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s，35 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并经天一辉远生物科技有限公司测序，将测序所得序列与GenBank 数据库中的已知序列对比分析，确定分离菌种类。

1.4 小鼠的致病性试验随机选取10 株CNS，采用平板菌落计数法计算菌液浓度，将菌液浓度稀释为1×108cfu/mL。将小鼠随机分成A、B 两组（A 组，n=10，雌雄各半；B 组，n=2，雌雄各一只），A 组小鼠根据体质量按0.02 mL/g 腹腔注射菌液，B 组小鼠注射同等量的无菌生理盐水。每3 h 观察小鼠的精神、饮食及死亡情况，剖检死亡小鼠观察病变，无菌采集心、肝、脾、肺、肾等脏器接种至LB 营养琼脂平板，培养24 h后选取优势菌进行革兰氏染色及生化试验，并与接种细菌对比，同时将采集的死亡小鼠脏器称重，加入1 mL无菌生理盐水研磨至匀浆，10倍倍比稀释，分别吸取各稀释度匀浆液200 μL 接种于LB 营养琼脂平板，37 ℃培养24 h，重复3 次，计算各器官载菌量。对7 d 后仍未发病死亡的小鼠迫杀，观察脏器是否发生病变。

1.5 分离菌的药物敏感性试验按照美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）制定的标准，采用K-B 纸片扩散法检测分离株对临床19 种常见抗生素的敏感性。

1.6 分离菌主要耐药基因的检测参照文献[8-12]并根据GenBank 登录的各类耐药基因序列，设计并合成β-内酰胺类（CTX-M、TEM、SHV、mecA）、磺胺类（sul1、sul2、sul3）、喹诺酮类（qnrA、qnrB、qnrS、aac（6）-Ib-cr）、大环内酯类（ermA、ermB、ermC、msrA）、四环素类（tetK、tetL、tetM、tetO）5 大类共19 对耐药基因引物，以1.4 提取的各分离菌基因组DNA 为模板进行耐药基因检测。用于扩增以上基因的引物由天一辉远生物科技有限公司合成。

1.7 耐药表型与耐药基因的相关性分析将各分离菌的耐药基因检测结果与药敏试验结果进行比较，分别计算耐药符合率、敏感符合率和总符合率，分析各分离菌耐药表型与耐药基因的相关性。

耐药符合率（%）=耐药基因阳性耐药菌株数/（耐药基因阳性耐药菌株数+耐药基因阴性耐药菌株数）×100%；敏感符合率（%）=耐药基因阴性敏感菌株数/（耐药基因阳性敏感菌株数+耐药基因阴性敏感菌株数）×100%；总符合率（%）=（耐药基因阳性耐药菌株数+耐药基因阴性敏感菌株数）/（耐药基因阳性菌株数+耐药基因阴性菌株数）×100%。

2 结 果

2.1 病原菌的分离鉴定结果279 份羊鼻拭子样品经血平板初次分离，结合鉴别培养基纯化培养和16S rRNA 基因测序分析，结果显示，分离菌在甘露醇氯化钠琼脂培养基上呈黄色或红色菌落，革兰氏染色阳性，菌体呈球形或椭圆形，排列成葡萄状。16S rRNA 基因序列对比分析结果显示共分离得到46株葡萄球菌，其中检出41 株CNS，检出率为14.7%（41/279），溶血葡萄球菌检出率最高，为19.6%（9/41），其次为腐生葡萄球菌和科氏葡萄球菌，检出率分别为15.2%（7/41）和13%（6/41）；CPS 的检出率为12.2%（5/41）（表1）。结果表明，CNS 在羊呼吸道疾病中的检出率较高，且种类多样。

表1 葡萄球菌分离株数量及检出率Table 1 Staphylococcus isolates and detection rate

2.2 小鼠的致病性试验结果随机选取10 株CNS，采用腹腔注射的方式感染小鼠，结果显示：感染组小鼠在24 h 内出现精神沉郁，被毛粗乱，个别小鼠震颤的症状，感染小鼠在注射后24 h～36 h 死亡，死亡率为30%（3/10），剖检死亡小鼠可见肺脏有出血点、肾脏肿大等，从死亡小鼠脏器中分离到的细菌经鉴定与注射细菌一致。经小鼠器官载菌量检测，结果显示，CNS 分布于小鼠各个脏器，其中以脾脏和肺脏载菌量最多，心脏、肝脏和肾脏载菌量差异不大（表2），接种菌液未死亡的小鼠逐渐恢复正常，对照组小鼠则生长良好，剖检脏器未发现肉眼可见的病变。表明分离的CNS 对小鼠具有较强的致病性。

表2 各组小鼠各脏器载菌量检测结果（cfu/g）Table 2 Bacterial load in various organs(cfu/g)

2.3 药物敏感性试验结果采用K-B 纸片扩散法检测41 株CNS 对19 种抗生素的敏感性。结果显示：所有CNS 均对头孢吡肟敏感，对青霉素耐药率75.6%（31/41），对阿奇霉素、红霉素、苯唑西林和克林霉素耐药率分别为68.3%（28/41）、68.3%（28/41）、65.9%（27/41）和65.9%（27/41）（表3）；所有CNS 均存在不同程度的耐药且至少对2 种抗生素耐药，其中耐6 种抗生素和9种抗生素的比例各占14.6%（6/41），耐3种抗生素的比例占12.2%（5/41），此外，1株CNS耐14种抗生素，3 株CNS 耐13 种抗生素（图1）。结果表明：41株CNS 耐药性均较强，且多重耐药现象严重。

图1 41株CNS多重耐药统计结果Fig.1 Statistics of multi-drug resistance of the 41 CNS strains

表3 41株CNS的药敏试验结果Table 3 Results of drug susceptibility test of 41 CNS strains

2.4 耐药基因检测结果利用PCR 对41 株CNS 的5大类药物共19 对耐药基因进行检测。结果显示：共检测到4 类共9 种耐药基因，大环内酯类耐药基因ermC和msrA的检出率较高，分别为46.3%（19/41）和24.4%（10/41），其次为β-内酰胺类耐药基因mecA，检出率为31.7%（13/41）；β-内酰胺类耐药基因TEM、SHV的检出率较低，分别为7.3%（3/41）和4.9%（2/41）。未检出β-内酰胺类耐药基因CTX-M、磺胺类耐药基因sul2和sul3、喹诺酮类耐药基因qnrA和qnrB、大环内酯类耐药基因ermA及四环素类耐药基因（表4）。结果表明，广东羊源CNS 携带耐药基因种类复杂。

表4 分离菌耐药基因检测结果Table 4 Detection results of drug resistance genes in isolates

2.5 耐药表型与耐药基因的相关性分析通过对耐药基因阳性与阴性菌株的耐药谱对比分析，并计算耐药符合率、敏感符合率和总符合率。结果显示：耐药基因ermC、aac（6）-Ib-cr、mecA和sul1与耐药表型的耐药符合率较高，分别为50%、45.5%、40.7%和40%，所有耐药基因与耐药表型的敏感符合率均较高，为71.4%～100%。综合耐药符合率和敏感符合率，耐药基因ac（6）-Ib-cr和sul1与耐药表型的总符合率最高，均为85.4%，其次为qnrS和aadA，耐药基因与耐药表型的总符合率分别为80.5%和70.8%（表5）。总之，分离菌对磺胺类、喹诺酮类的耐药表型与耐药基因基本相符，β-内酰胺类和大环内酯类的耐药表型与耐药基因相关性较低。结果表明，41 株CNS 的耐药表型和耐药基因之间存在一定的相关性。

3 讨 论

羊的呼吸道疾病是发病率最高的疾病之一，对养羊业造成了巨大经济损失。由于广东各地羊养殖场呼吸道疾病频发，本研究从患呼吸道疾病的羊鼻拭子中共分离41 株CNS，分离率为14.7%。目前对动物中CNS 的研究主要基于乳房炎，对CNS 在动物鼻中的定植知之甚少。有研究报道，通过对80 只上呼吸道感染的马驹和20 只健康的马驹鼻腔进行病原分离鉴定，结果显示患病动物组中有18 只（22.5%）分离到致病菌，其中CNS 和不动杆菌为优势菌，分别占100%和45%[13]。而在一项针对野猪鼻腔CNS 的研究中，CNS 的检出率为36.6%（136/371）[14]。在欧洲野兔中也分离到CNS，其中检出率最高的为福氏葡萄球菌[15]。Abdel-Moein 等研究发现，由CNS 导致的绵羊和山羊呼吸道疾病发病率分别为10.3%和18.8%[16]。

本研究对41 株羊源CNS 进行临床常用药物敏感性试验后发现，分离菌对β-内酰胺类、大环内酯类及林可酰胺类抗生素耐药现象严重，该结果与我国东北地区[17]、呼伦贝尔地区[18]牛源CNS 对这几种受试药物的耐药率基本一致。研究报道，通过对西班牙某屠宰场的117 只家畜鼻拭子样品进行研究，结果显示，共分离得到47 株CNS，其中22 个分离株（47%）至少对其中一种抗生素耐药，对四环素、克林霉素、红霉素、青霉素和复方新诺明耐药率分别为23.4%、19.1%、10.6%、4.3%和2.1%，耐药水平均低于本研究[19]。在一项针对住院患者鼻腔CNS 的研究中，分离菌对青霉素、红霉素及克林霉素的耐药率分别为91.7%、91.7%和50%，耐药水平与本研究相近[20]。Vasileiou 等对分离自隐性乳房炎的142 株葡萄球菌进行耐药性分析，结果显示，分离株对青霉素和四环素的耐药率分别为22.5%和18.3%[21]。通过对耐药基因阳性菌株与阴性菌株的耐药谱分析，41 株CNS 对β-内酰胺类抗生素的耐药表型和耐药基因总符合率较低，可能是由于其β-内酰胺类抗生素中青霉素类和头孢菌素类耐药程度的不同，且随着头孢菌素类抗生素代数的增加，受试菌的耐药性逐渐降低所致。另外，耐药表型和耐药基因相关性较低，也可能是细菌通过其他耐药机制获得对抗生素的耐药性。

综上所述，广东省羊源CNS 的耐药情况较为严重，许多分离菌均呈现多重耐药现象，对青霉素高度耐药，耐药菌株占75.6%。因此，需合理使用抗生素，用药前根据药敏试验结果选择药物，减少预防性用药，严禁使用人用抗生素。另外，应加强对本地区的耐药监测，掌握细菌的耐药趋势，防止耐药基因的扩散与流行。