牛源肉孢子虫多重PCR 检测方法的建立

韩利方，马超锋，钱伟锋，张 旻，位治国，闫文朝*

（1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471023；2.信阳市动物疫病预防控制中心，河南 信阳 464000）

肉孢子虫病是一种食源性人兽共患寄生虫病，能感染人、哺乳动物和鸟类等多种宿主[1-3]。目前能感染牛的肉孢子虫主要有5 种，分别为枯氏肉孢子虫（Sarcocystis cruzi）、毛样肉孢子虫（S. hirsuta）、罗氏肉孢子虫（S. rommeli）、人肉孢子虫（S. hominis）和黑氏肉孢子虫（S. heydorni）[4-6]。黄牛、奶牛和野牛等牛科动物是这5 种肉孢子虫的中间宿主，犬科动物或猫科动物或灵长类为终末宿主[4,6-7]。枯氏肉孢子虫是牛群中的优势虫种，并且对牛致病性最强，该虫种可寄生于牛横纹肌、心肌和中枢神经系统，引起发热、贫血、嗜酸性粒细胞肌炎、流产、神经症状和死亡等症状和病变[4,8]。人肉孢子虫和黑氏肉孢子虫还可引起人牛的感染和发病，具有重要的公共卫生意义[3,6]。其他虫种对牛也表现不同程度的致病性[4]。

牛肉是国人常见的肉食品，保证牛肉的卫生安全非常重要。常规的肌肉压片镜检不能区分5 种牛源肉孢子虫[8-9]。多重PCR 具有灵敏、特异和便捷等特点[10-11]，因此本研究基于各肉孢子虫的18S rDNA或COX1 序列，建立了多重PCR 方法，能快速检测样品中5 种牛源肉孢子虫，为牛和人肉孢子虫病诊断和分子流行病学研究提供更有效的分子检测工具。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料2×EasyTaq®PCR SuperMix、DL2000 Plus DNA Marker、EasyPure®Quick Gel Extraction Kit、pEASY-T1 克隆载体、EasyPure®Plasmid MiniPrep Kit 购自北京全式金生物技术有限公司；细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；从洛阳地区超市和冷鲜肉专卖店购买新鲜牛肉，经肌肉压片镜检和18S rDNA 分子鉴定为枯氏肉孢子虫、毛样肉孢子虫、罗氏肉孢子虫和黑氏肉孢子虫包囊阳性样品，组织匀浆后，用细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒提取上述4 种肉孢子虫阳性的牛肉样品、米氏肉孢子虫阳性的猪肉样品、刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子基因组DNA。这些肉样和不同虫种基因组DNA 于-20 ℃保存于河南科技大学动物科技学院寄生虫学实验室。

1.2 引物设计与合成参照GenBank 中毛样肉孢子虫（KT901163）、黑氏肉孢子虫（KX057997）、人肉孢子虫（KF954731）的18S rDNA 序列和枯氏肉孢子虫（KC209598）、罗氏肉孢子虫（KY120291）的COX1 序列，利用DNAStar-MegAlign 软件序列比对后，参照文献[12-13]，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成相关序列各虫种特异区引物（表1）。

1.3 重组质粒标准品的制备与鉴定以枯氏肉孢子虫、黑氏肉孢子虫、罗氏肉孢子虫和毛样肉孢子虫阳性肉样的基因组DNA为模板，采用肉孢子虫属通用引物扩增18S rDNA 序列（SAR18SF：5′-GCTCTGAG ATGAAAGTCTAG-3′，SAR18SR：5′-TCCTTCCGCCGT ATTATC-3′）或COX1 序列（SARCOX1F：5′-GGTATCT TTAGCGTTGTTGGT-3′，SARCOX1R：5′-GCCGAAT TACGAATGATATGGC-3′），并克隆至pEASY-T1 载体中，通过菌落PCR 和测序鉴定获得重组质粒pEASY-T1-Shir18S rDNA、pEASY-T1-Shey18S rDNA、pEASY-T1-ScruCOX1、pEASY-T1-SromCOX1；根据GenBank 中人肉孢子虫18S rDNA 序列（KF954731），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成人肉孢子虫18S rDNA 序列，并克隆至pEASY-T1 载体中，通过菌落PCR 和测序鉴定获得重组质粒pEASY-T1-Shom18S rDNA。用分光光度计测定和计算这5 种重组质粒的浓度（ng/μL），计算质粒的拷贝数，将5 种质粒浓度均调整为6×109拷贝/μL 作为标准品质粒用于后续试验[10,12]。

1.4 单一PCR 反应条件的优化参考相关文献[12]，采用25 μL 反应体系，以5 种质粒标准品作为DNA模板，分别以每种肉孢子虫的单对引物进行单一PCR 扩增，引物浓度设置为2.0 μmol/L、1.5 μmol/L、1.0 μmol/L、0.5 μmol/L。PCR 扩增程序：94 ℃5 min，94 ℃40 s、51 ℃～59 ℃30 s、72 ℃60 s，共35 个循环，72 ℃10 min。采用方阵法优化枯氏肉孢子虫、人肉孢子虫、黑氏肉孢子虫、罗氏肉孢子虫和毛样肉孢子虫PCR 最佳引物浓度和退火温度。

1.5 多重PCR 反应条件的优化参考1.4 中单一PCR 最佳引物浓度，将牛源肉孢子虫的5 对引物混合后进行PCR 检测，确定引物间无干扰后，将5 种肉孢子虫的重组质粒标准品等体积混合后（终浓度均为6×104拷贝/μL）作为模板，退火温度设置为51 ℃～59 ℃，其他条件参照1.4， 采用方阵法优化最佳多重PCR 退火温度。

1.6 多重PCR 方法的特异性试验采用优化后的多重PCR 反应条件，以刚地弓形虫和犬新孢子虫速殖子基因组DNA、米氏肉孢子虫、枯氏肉孢子虫、毛样肉孢子虫、罗氏肉孢子虫和黑氏肉孢子虫包囊基因组DNA、人肉孢子虫重组质粒标准品为模板，进行多重PCR扩增，以评价多重PCR方法的特异性[10-12]。

1.7 多重PCR 方法的敏感性试验采用优化后的多重PCR 和单一PCR 反应条件，分别以10 倍倍比稀释的5 种牛源肉孢子虫重组质粒标准品混合物（0.6拷贝/μL～6×104拷贝/μL）为模板，进行多重PCR 和单一PCR 扩增，评价多重PCR 方法的敏感性[10-12]。

1.8 临床样品的检测选取34 份牛肉样品，每份样品采集3 g～5 g 肉样匀浆，再利用细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒提取组织总DNA，采用本研究建立的多重PCR 方法对提取的基因组DNA 进行扩增。同时采用肌肉压片镜检方法检测这些临床样品肉孢子虫，比较二者的检测结果，并计算二者的符合率[12]。

2 结 果

2.1 重组质粒标准品的鉴定结果经菌落PCR鉴定和测序分析结果显示，重组质粒pEASY-T1-Shir18SrDNA、pEASY-T1-Shom18SrDNA、pEASY-T1-Shey18S rDNA、pEASY-T1-ScruCOX1、pEASY-T1-SromCOX1均正确构建。利用Nanodrop 2000 测定质粒的浓度再根据公式计算重组质粒标准品的拷贝数，结果显示pEASY-T1-Shir18SrDNA为3.55×1010拷贝/μL；pEASYT1-Shom18SrDNA 为4.78×1010拷贝/μL；pEASY-T1-Shey18SrDNA 为3.99×1010拷贝/μL；pEASY-T1-Scru-COX1 为3.52×1010拷贝/μL；pEASY-T1-SromCOX1 为5.01×1010拷贝/μL。将5 种重组质粒均调整至6.0×109拷贝/μL，作为标准品质粒，用于后续PCR 扩增的阳性模板。

2.2 单一PCR 反应条件的优化结果经过单一PCR 优化结果显示，反应体系为25 μL，利用设计的引物（表1）均可扩增出目的条带，5 种牛源肉孢子虫特异有效的引物浓度均为0.5 μmol/L，即每管加入1 μL 12.5 μmol/L 的上、下游引物。5 种牛源肉孢子虫引物的最佳退火温度是54 ℃～58 ℃，循环中的延伸时间是40 s～60 s。

表1 牛源肉孢子虫多重PCR的检测引物Table 1 Primers used in the Multiplex PCR for the detection of the Sarcocystis species

2.3 多重PCR 反应条件的优化结果多重PCR 优化结果显示，反应体系为25 μL，最佳引物工作浓度均为0.5 μmol/L，即每管加入1 μL 12.5 μmol/L 的上、下游引物，各引物混合后扩增无引物二聚体，无相互干扰。最佳PCR 扩增条件为94 ℃5 min，94 ℃40 s、56 ℃40 s、72 ℃60 s，共35个循环，72 ℃10 min。利用优化后的退火温度和引物浓度等参数进行扩增的结果显示，5 种PCR 扩增产物大小均与预期一致，罗氏肉孢子虫引物（CROMF/R）扩增长度为287 bp；枯氏肉孢子虫引物（CCRUF/R）扩增长度为400 bp；人肉孢子虫引物（CHOMF/R）扩增长度为530 bp；毛样肉孢子虫引物（CHIRF/R）扩增长度为1 007 bp；黑氏肉孢子虫引物（CHEYF/R）扩增长度为643 bp，片段大小差别明显，易于区分（图1）。

图1 牛源肉孢子虫多重PCR反应条件优化结果Fig.1 The amplification results of the Multiplex PCR for detecting the Sarcocystis species

2.4 多重PCR 的特异性试验结果特异性试验结果显示，本研究建立的多重PCR 方法对米氏肉孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫基因组等样品均未扩增出目的条带，而枯氏肉孢子虫、毛样肉孢子虫、罗氏肉孢子虫和黑氏肉孢子虫包囊基因组DNA、人肉孢子虫的重组质粒标准品均扩增出预期大小的目的条带（图2），表明本实验建立的多重PCR 具有较强的特异性。

图2 牛源肉孢子虫多重PCR特异性试验结果Fig.2 The specificity of the Multiplex PCR for detecting the Sarcocystis species

2.5 多重PCR 的敏感性试验结果敏感性试验结果显示，多重PCR 对5 种牛源肉孢子虫重组质粒标准品的最低检测限为6 拷贝/μL（图3）。5 种单一PCR 的最低检测限也为6 拷贝/μL，与多重PCR 基本一致（图略）。表明本实验建立的多重PCR 具有较高的敏感性。

图3 牛源肉孢子虫多重PCR敏感性试验结果Fig.3 The sensitivity of the Multiplex PCR for detecting the Sarcocystis species

2.6 临床样品的检测结果该多重PCR 方法对34份牛肉样品的检测结果显示，有6 份样品为枯氏肉孢子虫阳性，3 份毛样肉孢子虫，2 份罗氏肉孢子虫，未检出人肉孢子虫和黑氏肉孢子虫。肌肉压片镜检结果显示，有9 份样品为肉孢子虫包囊阳性，无法鉴定到种。经计算，本研究建立的多重PCR 检测结果与肌肉压片镜检阳性符合率为100%，阴性符合率为92%，总体符合率为94.1%（表2）。表明该研究建立的多重PCR 比肌肉压片镜检具有更高的敏感性，可用于临床样品检测。

表2 临床样品的检测结果Table 2 Comparison of the Multiplex PCR with the microscopic observation of squashing slides

3 讨 论

肉孢子虫在牛群中有较高的感染率[13-15]。目前5种牛源肉孢子虫的生活史均研究清楚，这5 种肉孢子虫的中间宿主均是奶牛、肉牛和野牛等牛科动物。牛食入肉孢子虫卵囊或孢子囊后，裂殖生殖阶段的虫体可存在于牛的全身各脏器的血管内皮细胞内和血液内，包囊寄生于横纹肌、心肌和中枢神经系统内[6-7,16]。枯氏肉孢子虫对牛的致病性最强，食入20 万个孢子囊，即可引起牛发热、瘫痪、流产和死亡[17]。感染有黑氏肉孢子虫和人肉孢子虫包囊的牛肉被人食入后，在人的小肠进行配子生殖和孢子生殖，引起呕吐、腹泻等症状，随人的粪便排出卵囊或孢子囊[6]。因此，可以通过检测牛的血液、脏器、肌肉、脑组织和人、犬、猫等终末宿主的粪便等样品中肉孢子虫不同阶段虫体，为防控牛和人的肉孢子虫病提供重要依据。

肉孢子虫常用的检测方法是肌肉压片镜检法，但是显微镜下不能辨别不同虫种，而且牛肉中的肌间脂肪等组织与肉孢子虫包囊形态结构相似，容易混淆[9]。ELISA 抗体检测试剂盒只能检测肉孢子虫抗体，也不能区分不同虫种[8]。PCR 技术可以实现对病原基因组DNA 进行指数级快速扩增，具有敏感、特异的优点[15-16]。基于多对引物的多重PCR 技术可以实现同时对同一份样品中多种病原或同种病原不同亚型的鉴别检测，具有简便、快速的优点[10-12]。本研究利用5 种牛源肉孢子虫的18S rDNA 或COX1 序列种特异引物，建立牛源肉孢子虫多重PCR鉴别检测方法，通过一次PCR 检测就能准确区分枯氏肉孢子虫、毛样肉孢子虫、罗氏肉孢子虫、黑氏肉孢子虫和人肉孢子虫。除了牛肉样品外，推测该多重PCR方法还可以用于牛的血液、脏器和犬、猫、人等终末宿主粪便样品中肉孢子虫的鉴定，这有待于进一步试验。

本研究用到的枯氏肉孢子虫、毛样肉孢子虫、罗氏肉孢子虫和黑氏肉孢子虫的重组质粒标准品中的目的基因18S rDNA 或COX1序列均来源于本实验前期分离的肉孢子虫包囊阳性样品。另外，由于本实验没有分离到人肉孢子虫样品，参考GenBank 里人肉孢子虫18S rDNA 序列，委托生物公司合成了1 849 bp 的18S rDNA序列，然后克隆至pEASY-T1克隆载体中，得到重组质粒pEASY-T1-Shom18SrDNA，作为阳性标准对照样品。与直接来源于肉孢子虫包囊或孢子囊的基因组DNA 相比，5 种牛源肉孢子虫的重组质粒标准品可以体外重复批量化生产，对将来组装商品化牛源肉孢子虫多重PCR 检测试剂盒来说具有更高的可行性[12]。总之，本研究首次建立的5 种牛源肉孢子虫多重PCR鉴别检测方法可以用于检测牛肉等相关样品中肉孢子虫的感染情况，为牛和人肉孢子虫病诊断和分子流行病学研究提供重要的分子检测工具。