猪链球菌三价灭活苗的制备及对小鼠免疫效果的评价

崔丽荣，王嘉珍，李 亮，何长生，邢 刚，刘雪兰，孙 裴，魏建忠，李 郁*

（1.安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036；2.安徽动物疫病预防与控制中心，安徽 合肥 230091；3.马鞍山史记动物健康管理有限公司，安徽 马鞍山 238251）

猪链球菌病是由链球菌属中猪链球菌（Streptococcus suis，SS）、马链球菌类马亚种、马链球菌兽疫亚种和兰氏分群中D、E、L 群链球菌引起的一种常见猪传染病。其中，SS 是世界范围内引起猪链球菌病最主要的病原。在SS 已知的35 种血清型中，以血清2 型（Streptococcus suisserotype 2，SS2）分离率最高，致病力最强[1]。然而，近年来血清3 型（Streptococcus suisserotype 3，SS3）和血清4 型（Streptococcus suisserotype 4，SS4）在国内外发病猪中均较为普遍且分离率呈逐年上升的态势，甚至成为局部地区的优势血清型[2-6]。本实验室于2018 年～2020 年对安徽、江苏、山东、河北、广西等地区发病猪细菌流行病学调查结果显示，SS2 分离率最高，其次是SS4 和SS3。

一直以来抗生素是养殖企业治疗猪链球菌病的主要手段，但长期不合理的滥用乱用，致使SS 耐药问题日趋严重[7]。在当前全面开展减抗、限抗并逐步朝向禁抗的大趋势下，疫苗免疫则成为预防猪链球菌病的有效措施。目前已有的商用SS 疫苗主要针对SS2 和SS7（Streptococcus suisserotype 7，SS7），尚未有SS3 和SS4 疫苗。由于SS 血清型众多，不同血清型菌株之间缺乏交互免疫力，流行血清型的分布情况也随着地理区域不同而有所变化，所以在生产实际中常会出现疫苗接种后免疫效果不确实的现象。灭活苗凭借其使用安全，研制周期短，易于保存及运输等优点在临床上普遍应用，而多价灭活苗能对多种血清型菌株产生免疫保护作用。因此，开展SS 多价灭活苗的研制意义显著。

本研究将筛选出的3 株用于制备疫苗的SS 菌株（代号/血清型分别为HF2/SS2，BB15-4/SS3，HBgu18-4/SS4）经甲醛灭活后、以ISA 201VG 矿物油佐剂进行配比乳化，制备灭活前为1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 种活菌浓度的SS 三价（血清2、3、4 型）灭活苗，进而以昆明鼠为动物模型进行免疫效果评价，同时与SS 商用疫苗作平行比较，为新型SS 三价灭活苗的研发提供技术储备，为有效防控猪链球菌病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、疫苗及实验动物SS2、SS3 和SS4 疫苗用菌株代号分别为HF2、BB15-4、HBgu18-4，攻毒菌株代号分别为BZ1、BB15-4、HBgu18-4，均由安徽农业大学动物传染病实验室筛选与保存[8-9]（表1）；猪链球菌病三价灭活疫苗（C 群XS 株、SS2 LT 株和SS7 YZ 株）购自武汉科前生物股份有限公司（生产批号：20200406）；体质量为18 g～22 g、6 周龄～8 周龄清洁级雌性昆明鼠购自安徽医科大学动物实验中心。

表1 菌株的背景信息Table 1 Background information of Streptococcus suis strains used in this study

1.2 主要试剂酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂（TSAYE）、酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）均购自绍兴天恒生物科技有限公司；矿物油佐剂ISA 201VG购自法国赛比克公司；甲醛溶液购自上海苏懿化学试剂有限公司；小鼠脾脏组织淋巴细胞分离试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）购自美国博士德生物工程有限公司；细胞因子ELISA 检测试剂盒（IL-4、IL-10、IFN-γ、TFN-β、MCP-1）购自美国RB 公司；流式细胞抗体试剂盒购自上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.3 SS 三价（血清2、3、4 型）灭活苗的制备与检验将3 株制苗菌株培养液中的活菌数均分别调整为1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 种浓度后细菌灭活，其中SS2、SS3 试验菌株（HF2、BB15-4）用终浓度为0.3%的甲醛、37 ℃条件下灭活15 h，SS4 试验菌株（HBgu18-4）用终浓度为0.15%的甲醛、37 ℃条件下灭活11 h。以ISA 201VG矿物油佐剂配比乳化，制备3 种活菌浓度的SS 三价灭活苗，依次命名V-a、V-b 和V-c，待疫苗检验合格后[10]，利用昆明鼠进行免疫效果评价。

1.4 昆明鼠分组及免疫将190 只小鼠，随机分成6 组（编号分别为A、B、C、D、E、F）。其中A～D组为免疫组（每组35 只小鼠），依次免疫V-a、V-b、V-c、商用疫苗；E、F 组分别为攻毒对照组（35 只小鼠）和阴性对照组（15 只小鼠），均接种等体积灭菌生理盐水。接种剂量均为0.2 mL/只，接种途径均为颈部皮下多点注射。接种2 次，间隔14 d。

1.5 各组小鼠血清中IgG 抗体检测于首免后14 d与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清，每组3只。用全菌体超声裂解物包被酶标板，参照文献[11]中的ELISA 方法检测HF2（SS2）、BB15-4（SS3）、HBgu18-4（SS4）免疫小鼠后血清中的IgG 抗体效价。

1.6 各组小鼠的血清杀菌试验于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清，每组3 只，血清经56 ℃热处理30 min 为灭活补体。免疫组为小鼠血清+健康豚鼠血清（补体）+菌悬液（分别为BZ1、BB15-4、HBgu18-4，以生长菌落数为100 cfu～200 cfu的菌液稀释浓度为试验菌悬液浓度。下同）；抗体对照组为小鼠血清＋健康豚鼠血清（灭活补体）+菌悬液；补体对照组为PBS 稀释液+健康豚鼠血清（补体）+菌悬液；体系对照组为PBS 稀释液+健康豚鼠血清（灭活补体）+菌悬液。各组置37 ℃孵育1 h 后，涂布于TSA-YE 培养基，培养24 h 后进行菌落计数，杀菌率（%）=[1-免疫组菌落数/补体对照组菌落数]×100%，若免疫组孔内菌落的数量为补体对照孔的50%以下即判为“杀菌”，否则判为“不杀菌”。

1.7 各组小鼠血清中相关细胞因子含量的测定于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清，每组3 只。利用相应细胞因子试剂盒对各组小鼠产生的白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素10（IL-10）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的细胞因子含量进行检测。

1.8 各组小鼠脾淋巴细胞增殖试验首免14 d 和二免7 d 后，采集各免疫组和阴性对照组小鼠，每组3只。将断颈处死后的小鼠，在75%乙醇中浸泡消毒3 min～5 min 后，无菌取出脾脏，利用小鼠脾淋巴细胞分离试剂盒制备脾淋巴细胞悬液，以噻唑蓝溴化四唑比色法（MTT 法）测定脾淋巴细胞增殖指数（SI），SI=免疫孔OD570nm均值/阴性对照孔OD570nm均值[12]。

1.9 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+ T 细胞亚群百分比的测定于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D组和F 组小鼠外周血至抗凝管，每组3 只。取抗凝管中的100 μL 外周血至2 mL 无菌离心管中，加入1.8 mL 红细胞裂解液，颠倒混匀后静置30 min。1 500 r/min 离心5 min，弃上清液。加入1.8 mL 无菌PBS 缓冲液（pH=7.2）反复吹吸。1 500 r/min 离心10 s，弃去多余液体，保留约200 μL～300 μL 的液体和白细胞于管底，吹打混匀。设4 个阴性对照组，第1 组只加入红细胞裂解液，不加荧光抗体染色；另外3 组分别加入CD3+、CD4+和CD8+单一荧光染料。将各组样品混匀后置4 ℃避光孵育30 min。用无菌PBS 缓冲液（pH=7.2）洗涤孵育后的样品，2 500 r/min 离心5 min，弃上清液，加入500 μL 无菌PBS 缓冲液（pH=7.2），吹打混匀。将各组细胞悬液转移至流式管。利用流式细胞仪检测并分析数据[13]。

1.10 各组小鼠的免疫保护率测定二免7 d 后，将免疫组（A～D）小鼠分别再分为3 组（编号分别为A1～A3、B1～B3、C1～C3、D1～D3），另设攻毒对照组（E1～E3）和阴性对照组（F1～F3），每小组5 只。采用腹腔注射的方式对小鼠攻毒，攻毒菌株分别为BZ1（SS2）、BB15-4（SS3）和HBgu18-4（SS4），攻毒剂量分别为5LD100、5LD50和5LD50，阴性对照组注射灭菌生理盐水。攻毒后，观察各组小鼠的精神状态、饮食欲及死亡等情况，计算各组小鼠免疫保护率。免疫保护率（%）=[1-免疫组死亡率/对照组死亡率]×100%。

1.11 各组小鼠内脏组织荷菌数的测定在小鼠攻毒3 d、7 d 后，分别无菌采集感染小鼠的肺、肝、脾和肾脏于1.5 mL 离心管中，称量组织重量，按一定比例加无菌PBS 和磁珠研磨；10 倍倍比稀释后分别取原液、1∶10、1∶100 3 个稀释度的组织悬液1 mL，均匀涂布于TSA-YE 固体培养基，平板计数法测定不同菌株攻毒后各脏器（肺、肝、脾、肾）中的细菌菌落数。

1.12 各组小鼠病理组织学观察攻毒7 d 后，采集免疫组、阴性对照组和攻毒对照组小鼠的肺、肝、脾和肾脏，置于10%福尔马林中，24 h 后重新更换福尔马林，进行固定和保存，制作组织病理切片，观察各脏器的组织病理学变化。

1.13 数据处理本实验所有数据的差异性统计均采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析，数据绘图均使采用Graphpad.8.0 软件绘制。

2 结 果

2.1 各组小鼠血清中IgG 抗体检测结果于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清，通过间接ELISA 的方法检测各组小鼠血清中IgG 抗体水平。结果显示，首免后14 d 与二免后7 d，A～D 组小鼠的IgG 抗体含量始终保持相同水平，且均显著高于F 组（P＜0.05）。二免7 d 后，A～D 组的IgG 抗体水平显著上升（P＜0.05），F 组小鼠的IgG 抗体水平则无显著变化（P＞0.05）（表2）。表明制备的3 种活菌浓度的SS 三价灭活苗均可刺激小鼠产生较高水平的抗体，且与商用疫苗相一致，均为1∶12 800。

表2 SS三价灭活苗免疫小鼠血清中IgG抗体水平测定结果Table 2 Determination of IgG antibody level in serum of mice immunized with SS trivalent inactivated vaccine

2.2 各组小鼠的血清杀菌试验结果于首免后14 d与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清，进行血清杀菌试验。结果显示，补体对照组菌落数为120 cfu。首免14 d 后，A～D 组菌落数均高于补体对照的50%，对SS 不具有杀灭作用。二免7 d 后，A～D 组菌落数均显著降低，且低于补体对照组的50%，对SS具有杀灭作用且各组之间无统计学差异（P＞0.05），但与F 组差异显著（P＜0.05）。二免7 d 与首免14 d 相比，A～D 组菌落数均显著减少（P＜0.05），F 组菌落数始终无显著变化（P＞0.05）（图1）。表明制备的3 种浓度的SS 三价灭活苗免疫小鼠后，血清中的功能性抗体均具有高度杀菌活性，与商用疫苗无显著差异。

图1 各组小鼠血清杀菌试验结果Fig.1 Results of serum bactericidal test

2.3 各组小鼠血清中相关细胞因子含量的测定结果于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清，并按照细胞因子试剂盒说明书，对各组小鼠血清中的细胞因子含量进行检测。结果显示，首免后14 d 与二免后7 d，A～D 组小鼠血清中IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1 含量与F 组相比均有所升高（P＜0.05），且各免疫组间差异不显著（P＞0.05）（图2）。表明制备的3 种浓度的SS 三价灭活苗均可诱导小鼠产生较高水平的细胞因子，与商用疫苗无显著差异。

图2 小鼠血清中相关细胞因子检测结果Fig.2 Levels of detection of relevant cytokines in sera of mice

2.4 各组小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠血清并制备脾淋巴细胞悬液，以MTT 法进行脾淋巴细胞增殖试验。结果显示，首免后14 d 与二免后7 d，A～D 组小鼠脾淋巴细胞的SI值持续上升，F组小鼠的SI值始终无显著变化（P＞0.05）。二免7 d 后，A～D 组小鼠的SI 值持续上升且显著高于F 组（P＜0.05）（图3）。表明制备的3 种浓度的SS 三价灭活苗均能有效地刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，使其淋巴细胞不断活化、增殖和分化，从而增强机体的免疫应答能力，且与商用疫苗无显著差异。

图3 小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果Fig.3 Proliferation test results of spleen lymphocytes in mice

2.5 各组小鼠外周血中CD4+、CD8+ T 细胞亚群百分比测定结果于首免后14 d 与二免后7 d，采集A～D 组和F 组小鼠外周血，并采用流式细胞术检测CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T 细胞亚群含量。结果显示，首免14 d 后，A～D 组的CD4+/CD3+、CD8+/CD3+T细胞比率均显著高于F 组（P＜0.05）。二免7 d 后，A～D 组的CD8+/CD3+T 细胞比率均呈上升趋势。其中，B组的CD4+/CD3+T细胞比率显著高于A、C、D组P＜0.05），但A、C、D 组之间差异不显著（P＞0.05）（图4）。表明制备的3 种浓度的SS 三价灭活苗均可诱导小鼠T 细胞亚群比率持续升高，且B 组的诱导能力强于A、C、D 组。

图4 小鼠外周血中CD4+、CD8+细胞亚群在总T细胞中所占百分比Fig.4 Percentage of CD4+,CD8+subpopulations in peripheral blood of mice in total T cells

2.6 各组小鼠的免疫保护率测定结果二免7 d后，均以BZ1、BB15-4 和HBgu18-4 菌株攻毒免疫A～D 组和攻毒对照组（E 组）小鼠，阴性对照组（F组）接种等体积灭菌生理盐水，每组15 只，观察7 d，计算小鼠死亡率。结果显示，攻毒7 d 后，E组小鼠均死亡，F 组小鼠均存活，试验成立。在各免疫组中，B、C 组的免疫保护率均为100%，A、D组的免疫保护率分别为86.67%和80%（表3）。表明制备的3 种浓度的SS 三价灭活苗和商用疫苗均能使小鼠产生良好的免疫保护力。

表3 SS三价灭活苗对小鼠的免疫保护率测定结果Table 3 Immune protection rate of SS trivalent inactivated vaccine in mice

2.7 各组小鼠内脏组织荷菌数检测结果在小鼠攻毒3 d、7 d 后，采集不同脏器（肺、肝、脾、肾）测定组织荷菌数。结果显示，攻毒3 d 后，A～D 组小鼠的肺、肝、脾、肾脏组织中均有一定数量的细菌定植，且各组间无显著差异（P＞0.05），而与E 组差异显著（P＜0.05）；攻毒7 d 后，A～D 组BZ1 菌株菌落数为0 且与E 组不同组织器官的荷菌数差异显著（P＜0.05），A～C 组BB15-4 和HBgu18-4 菌株菌落数为0 且与D、E 组不同组织器官的荷菌数差异显著（P＜0.05），而D、E 组不同组织器官的荷菌数无显著差异（P＞0.05）（图5）。表明制备的3 种浓度的SS三价灭活苗均能有效清除SS2、SS3、SS4 在体内的定植，商用疫苗能有效清除SS2 在体内的定植。

图5 BZ1、BB15-4、HBgu18-4菌株感染后小鼠各脏器组织中的含菌量Fig.5 BZ1,BB15-4,HBgu18-4 bacterial content of bacteria in various organs of mice after infection

2.8 各组小鼠的组织病理切片观察结果于攻毒7 d后取A～F 组小鼠的肺、肝、脾、肾脏制作组织病理切片，观察组织病理变化。结果显示，A1～D1、A2～C2、B3、C3 组肺脏整体结构正常，未见明显炎性反应，D2 组肺间质轻微充血，A3、D3 组肺泡壁轻微增厚，但未见明显炎性细胞浸润（图6）。C1 组肝脏整体结构基本正常，A1、B1、D1组有少量炎性细胞浸润，A2～C2、D2 组肝细胞轻微水肿，A3～C3组肝窦轻微充血扩张，未见明显炎性反应，D3 组肝细胞轻微水肿，少量炎性细胞浸润（图7）。A1～C1、B2、C2、B3 和C3 组脾脏整体结构正常，D1～D3、A2～A3 组可见少量多核巨细胞浸润（图8）。A1～D1、C2、A3～C3 组肾脏整体结构基本正常，A2、B2 和D2组少量肾小球萎缩，未见明显炎性细胞浸润，D3组肾组织可见少量肾小球萎缩，未见明显炎性细胞浸润（图9）。

阴性对照组F 组小鼠各脏器均无明显病理变化（图6～图9）。攻毒对照组E1、E3 组小鼠肺泡壁明显增厚，E2 组肺泡融合扩张形成较大囊泡（图6）；E1、E2组肝细胞明显水肿，大量炎性细胞浸润，E3组肝窦间隙明显增大，明显炎性细胞浸润（图7）；E1、E2 和E3 组脾组织整体结构异常，红髓白髓界限不分明，组织可见大量多核巨细胞浸润（图8）；E1 组肾小管上皮细胞细胞核坏死溶解消失，仅存肾小管轮廓，E2 和E3 组整体结构异常，可见大量肾小管上皮细胞疏松水肿，少量肾小球明显萎缩（图9）。

图6 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各组小鼠肺脏组织病理学变化（HE染色，200×）Fig.6 Histopathological changes of lung in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

图7 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各组小鼠肝脏组织病理学变化（HE染色，200×）Fig.7 Histopathological changes of liver in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

图8 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各组小鼠脾脏组织病理学变化（HE染色，200×）Fig.8 Histopathological changes of spleen in each group ofmice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

图9 BZI、BB15-4、HBgu18-4攻毒后各组小鼠肾脏病理组织学变化（HE染色，200×）Fig.9 Histopathological changes of kidney in each group of mice after BZ1,BB15-4,HBgu18-4 attack(HE staining,200×)

综合3 种菌（BZ1、BB15-4、HBgu18-4 株）攻毒后各组小鼠组织（肺、肝、脾、肾脏）病理变化，表明制备的3 种浓度的SS 三价灭活苗免疫小鼠后，均可刺激机体产生良好免疫保护效果，且攻毒后对小鼠肺、肝、脾、肾脏的病理变化的损伤程度均较轻微。

3 讨 论

猪链球菌病是由SS 引起的以猪的脑膜炎、关节炎、心内膜炎以及败血症等临床症状为主要特征的细菌性传染病。近年来，随着全球养殖场集约化、规模化发展以及生猪频繁引种和调动，致使该病的发病率和致死率明显升高，给养猪业造成严重的经济损失[14]。抗生素和疫苗接种可用于猪链球菌病的防控，但长期不合理的使用抗生素，容易导致SS 耐药性的产生和耐药谱的拓宽，疫苗接种俨然成为防控该病的主要措施。但SS 血清型众多，不同血清型甚至相同血清型不同菌株之间缺乏有效的交叉保护力，且不同地区优势菌株分布常处于动态流行中，导致某些猪场虽开展了免疫工作却未达到理想的保护效果。因此，研制出交叉保护性强的SS 疫苗意义显著。灭活苗凭借研制周期短，使用安全，易制备多价、多联苗等优势，在临床上得以普遍应用，是生产实际中防制多种血清型菌株的最优选择。

不同血清型SS 菌株异质性明显，抗原性存在较大差别，因此鉴定与筛选疫苗用优势菌株，对地区性猪链球菌病的防控至关重要。此外，在疫苗制备的各个环节中，提高疫苗中的有效抗原含量是疫苗免疫效果的关键[15]。不仅如此，灭活条件和佐剂也是影响疫苗免疫效果的主要因素[16]。本实验室前期对某集团公司分布在安徽、江苏、山东、河北、广西等5 个地区的家庭农场，以及安徽地区不同规模养猪场（户）进行猪细菌病流行病学调查，发现主要以SS2、SS3 和SS4 的感染为主。进而通过小鼠致病性、抗原性和稳定性试验，综合筛选得到3 株用于制备疫苗的SS 菌株（HF2、BB15-4 和HBgu18-4株）。本研究在此基础上，将HF2 和BB15-4 株采用终浓度为0.3%的甲醛37 ℃条件下作用15 h；HBgu18-4 株采用终浓度为0.15%的甲醛37 ℃条件下作用11 h 后灭活，以ISA 201VG 矿物油佐剂配比乳化，制备灭活前分别为1.0×109cfu/mL、2.0×109cfu/mL、4.0×109cfu/mL 3 种活菌浓度的SS 三价灭活苗，以昆明鼠为实验动物模型，采用皮下多点注射途径与SS商用疫苗同步免疫昆明鼠，进行免疫效果评价。

IgG 抗体是血清中含量最多的抗体，且持续时间长，是机体抗感染免疫的主力，也是介导体液免疫的主要抗体[17]。但并非所有具有抗原结合能力的抗体均具有杀菌功能，而通过补体介导的血清杀菌试验能够直接反映出抗体的功能活性和疫苗的保护效果[18]。本研究中，A～D 组小鼠的IgG 抗体含量在整个免疫周期中始终保持相同水平，表明制备的3种浓度的SS 三价灭活苗与商用疫苗均能产生良好的体液免疫反应。血清杀菌试验结果显示，A～D 组小鼠免疫后血清中的功能性抗体均具有高度杀菌活性，表明其刺激机体产生的功能性抗体能够抵抗细菌的感染，具有良好的免疫保护作用。综合血清杀菌试验和IgG 抗体水平测定结果表明3 种浓度的SS三价灭活苗均可诱导小鼠产生大量特异性抗体与功能性抗体，可与机体免疫系统结合杀伤病原菌，与商用疫苗无显著差异。

脾脏是免疫活性细胞即T、B 淋巴细胞定植及发生适应性免疫应答的场所[19]。脾淋巴细胞的增殖能力决定其所产生效应淋巴细胞的数量和机体免疫应答反应的强度。T 淋巴细胞作为机体免疫系统中最重要的细胞群，可通过CD4+T 淋巴细胞（Th 细胞）和CD8+T 淋巴细胞（Tc 细胞）亚群释放大量细胞因子增强机体免疫应答水平。其中，CD4+T 淋巴细胞可分为Th1 和Th2 两个细胞亚群，Th1 细胞主要分泌IFN-γ、TNF-β 等，可刺激或增强细胞免疫应答反应；Th2 细胞主要分泌IL-4 和IL-10 等，辅助体液免疫反应。MCP-1 作为炎症反应的始动因子，既能介导体液免疫应答，也能促进细胞免疫应答[20]。而Tc 细胞可在Th 细胞的辅助作用下，发挥特异性杀伤的功能。因此，细胞因子水平是机体免疫功能状态的重要反映。本研究中，A～D 免疫组均可刺激小鼠脾淋巴细胞大量增殖，在诱导CD4+、CD8+T 淋巴细胞比率持续升高的同时还可刺激小鼠产生较高水平的细胞因子，表明3 种浓度的SS 三价灭活苗均可诱导机体产生细胞免疫反应，促进体液免疫反应，从而产生持久的免疫保护效果，与商用疫苗无显著差异。

SS 是一种常见的猪呼吸道细菌，常定植于扁桃体但不致病。当机体抵抗力下降时，SS 可从扁桃体向周围淋巴组织扩散，进入血液，进而侵袭不同组织器官，引起炎症反应，使机体相应部位形成病灶，造成机体的损伤或死亡。本研究从攻毒保护率、组织荷菌数、组织病理学方面，进一步分析比较了3 种浓度的SS 三价灭活苗以及商用疫苗的免疫保护效果。B～C 组的免疫保护率均为100%，优于A组（86.67%）和D 组（80%）。结合组织荷菌数分析和病理组织学变化证实，与阴性对照组相比，B～C 组的各组织器官的SS 荷菌数均降低且无显著差异，但相较于A 组，B～C 组的各组织器官病理变化较轻微或无明显病理变化。而D 组经BB15-4（SS3）和HBgu18-4（SS4）菌株攻毒后，均有一定数量的SS 定植且病理变化较明显，这可能与商用疫苗中不包含SS3 和SS4 抗原有关。说明SS 不同血清型之间缺乏交叉保护力，多数血清型菌株只对同源菌株产生免疫保护作用，而对异源菌株的免疫保护力较弱，因而无法切实有效地保护实际生产中SS 优势菌株的感染。因此，在面对SS 多种血清型感染的情况下，选择使用多价疫苗来防控猪链球菌病显得尤为重要，这不仅可对当前SS 动态流行防制特点提供切实保护，也是对目前商用疫苗无法满足生产实际需求的有效补充。

综合上述研究结果表明，3 种浓度的SS 三价灭活苗（V-a、V-b、V-c）免疫小鼠后均能产生良好的体液免疫和细胞免疫反应，其中，当SS 的浓度分别为2.0×109cfu/mL 和4.0×109cfu/mL（V-b、V-c）时，疫苗免疫保护效果最佳，其免疫的小鼠均可有效抵抗SS2、SS3、SS4 强毒株的攻击，可作为SS 三价（血清2、3 和4 型）灭活苗的候选疫苗。