绵羊肺炎支原体P113 蛋白和丝状支原体山羊亚种LppA 蛋白共表达质粒对小鼠免疫应答的研究

杨 鹏，吴 燕，岳 筠，陈 静，李 梅，王 慧，张双翔*，文 明,2，程振涛,2*

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008）

羊支原体肺炎（Mycoplasmal pneumoniaof sheep and goats，MPSG）是一种由绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，Mo）、丝状支原体山羊亚种（Mycoplasma mycoides subsp.capri，Mmc）和山羊支原体山羊亚种（Mycoplasma capricolum subsp.capricolum，Mcc）等支原体感染引起羊的一种高度接触性传染病，其中以山羊、绵羊最为易感，患病羊主要表现为消瘦、贫血、纤维素性肺炎和胸膜炎，严重时导致死亡[1-2]。贵州省作为我国的养羊大省，有贵州黑山羊、贵州白山羊和黔北麻羊3 种优秀山羊品种[3]。据调查显示，贵州省境内各品种羊场均有羊支原体肺炎流行，疫病的流行给养羊业带来严重的经济损失，免疫接种仍是该病主要的预防手段，目前MPSG 疫苗研究主要集中在弱毒疫苗和灭活疫苗方向[4]，然而弱毒疫苗存在安全性等问题，在国外部分国家已停止使用；国内目前主要使用灭活疫苗防控MPSG，而由于支原体体外培养困难，导致灭活疫苗成本较高，且存在灭活疫苗刺激机体免疫效果不佳和免疫保护时效短等问题[5]，因此，新型疫苗的研发显得十分迫切和必要。

近年来，核酸疫苗因其刺激免疫应答能力强、安全、可靠、生产方便、免疫途径多样等优点而受到越来越多的重视[6]。余波等构建的鸭疫里氏杆菌OmpA 基因真核重组质粒能够诱导雏鸭产生较强的体液免疫应答[7]，为核酸疫苗研究奠定了实验基础；田格如等研制的隐孢子虫AOX 基因和TSP6 基因重组质粒可为机体提供较强的免疫保护[8]。越来越多的研究者表示，核酸疫苗可作为当前新型疫苗研究的重点。据流行病学调查显示，贵州省MPSG致病菌主要为Mo 和Mmc[9-10]，本实验室前期已分离出Mo 和Mmc，通过生物信息学分析发现Mo P113 基因C 末端和Mmc LppA 基因N 末端具有较强的抗原性[11]，本研究利用已构建的pMD19-T-P113 克隆质粒和pMD19-T-LppA 克隆质粒为模板，构建真核重组质粒pVAX1-P113-LppA 并免疫小鼠，分析其对小鼠免疫应答的影响，以期为羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制及防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料大肠杆菌感受态细胞DH5α、pMD19-T-P113 克隆质粒、pMD19-T-LppA 克隆质粒、真核表达载体pVAX1、MDBK 细胞、羊源Mo 和Mmc 阳性/阴性血清、羊源P113 和LppA 蛋白、Mo GZ-QX 株、Mmc GZ-LD 株均由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存，其中Mo GZ-QX 株、Mmc GZ-LD 株均为1×1011ccu，且前期实验已确定二者对小鼠的最小致病剂量均为1×108ccu/mL。4～5 周龄BABL/c 小鼠均购自贵州医科大学实验动物中心。CD4-FITC、CD8-PE、PE-Cy5-CD3 小鼠单克隆抗体均购自科联生物科技有限公司；脂质体（LipofecttamineTM3000）购自Invitrogen 公司；E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit、无内毒素质粒大提试剂盒均购自Omega 公司；兔抗鼠IgG-HRP、兔抗羊IgG-FITC 购自博奥森公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、限制性内切酶Hind III、KpnI、BamH I、XhoI 均购自Ta-KaRa公司；小鼠白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）检测试剂盒均购自上海巧伊生物科技有限公司；HE（苏木素-伊红）染色试剂盒购自Solarbio 公司。

1.2 引物设计合成及重组质粒的构建参考Gen-Bank 中Mo GZ-QX1 株的P113 基因序列（KR270152）和Mmc PG3 株的LppA 基因序列（AF072715.1），分别选择抗原性良好的区域，结合真核表达载体pVAX1多克隆位点，利用primer5.0 各设计一对特异性引物，P113 基因选用Hind III 和KpnI 作为酶切位点（下划线）、LppA 基因选用BamH I 和XhoI 作为酶切位点（下划线），在两个基因5′端的酶切位点后分别添加Kozak 序列（波浪线）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列及预扩增长度见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

分别以pMD19-T-P113 质粒和pMD19-T-LppA 质粒为模板，采用表1 中相应引物分别经PCR 扩增，条件为：95 ℃5 min；95 ℃45 s，58 ℃40 s，72 ℃1 min，循环35 次；72 ℃10 min。采用胶回收试剂盒回收纯化PCR 产物后，将纯化后的P113 基因和pVAX1 载体分别利用Hind III 和KpnI 双酶切并回收后利用T4 连接酶16 ℃连接过夜，构建重组质粒pVAX1-P113。经PCR、双酶切及测序鉴定准确后，利用BamH I 和对XhoI 对pVAX1-P113 重组质粒及纯化后的LppA 基因分别双酶切后，利用快速连接试剂盒连接，构建重组质粒pVAX1-P113-LppA，并经PCR、双酶切及测序鉴定。

1.3 重组P113/LppA 蛋白表达的鉴定利用脂质体（LipofecttamineTM3000）将重组质粒pVAX1-P113-LppA转染MDBK 细胞，分别设置空白对照组、空载体pVAX1 对照组，于转染48 h 后收集各组MDBK 细胞，提取细胞总RNA 并反转录为cDNA 后作为模板，采用表1 中引物，经PCR 方法检测目的基因的转录情况；同时取各组上述MDBK 细胞爬片，重组质粒pVAX1-P113-LppA 组分别以Mo 阳性血清（1∶50）和Mmc 阳性血清（1∶50）为一抗，以兔抗羊IgG-FITC（1∶500）为二抗，采用间接免疫荧光试验（IFA）[12]检测目的基因在细胞中的表达情况。

1.4 重组质粒免疫小鼠后脾淋巴细胞增殖检测将实验小鼠随机分为Elution Buffer 对照组、空载体pVAX1（100 μg）对照组和重组质粒pVAX1-P113-LppA 组（100 μg）共3组，每组25只。前3 周每周经小鼠腿部肌肉注射免疫一次，共免疫3 次，分别于首免后0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d通过颌下静脉方式采血。并在每个时间点颈椎脱臼法迫杀2 只小鼠，无菌采集小鼠脾脏制备脾淋巴细胞悬液并计数，采用噻唑蓝比色法（MTT）检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖情况，每个样本设3 个重复孔，试验设培养基作为阴性对照调零。同时取首免疫后28 d的脾淋巴细胞，采用流式染色缓冲液调节细胞数为107个/mL，每管100 μL，向管中加入CD4-FITC、CD8-PE 和PECy5-CD3小鼠单克隆抗体，采用流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中T 淋巴细胞亚群（CD4+T 淋巴细胞、CD8+T 淋巴细胞）的变化。

1.5 免疫小鼠血清中特异性抗体及细胞因子检测采集1.4 中各组小鼠各时间点血清，以2.0 μg/孔P113 蛋白或LppA 蛋白作为包被抗原，加入待检血清（1∶50），以兔抗鼠IgG-HRP（1∶8 000）为二抗，采用间接ELISA 方法检测每组小鼠血清特异性抗体。另外，利用相应试剂盒分别检测每组小鼠血清细胞因子（IL-2、IL-4 和IFN-γ）的含量。

1.6 免疫小鼠攻毒保护性试验分别取末次免疫14 d 后的各组10 只小鼠随机分为2 组，分别经肌肉注射感染Mo GZ-QX 株（1×108ccu/mL）菌液和Mmc GZ-LD 株（1×108ccu/mL）菌液1 mL，7 d 内观察小鼠的精神、食欲等症状，出现其中之一症状则判定为发病，统计各组小鼠的发病情况和免疫保护率，并于攻毒后14 d 将Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组发病小鼠和重组质粒pVAX1-P113-LppA 未发病小鼠迫杀2 只，取小鼠肺脏组织制作切片，HE 染色后观察发病小鼠与免疫小鼠肺部组织的变化。

1.7 数据的统计学分析数据表示为3 次独立重复试验的平均值±标准差；利用SPSS20.0 及GraphPad Prism 7 软件分析小鼠首次免疫后不同组间0、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d 脾淋巴细胞增殖、血清特异性抗体及细胞因子（IL-2、IL-4 和IFN-γ）的差异性，以及分析不同组小鼠末次免疫14 d 后的T 淋巴细胞亚群（CD4+T 淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞）的变化。P＜0.05 表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 目的基因的扩增及重组质粒的鉴定结果分别以pMD19-T-P113 和pMD19-T-LppA 为模板，经PCR分别扩增到696 bp（P113 基因）和450 bp（LppA 基因）的目的条带（图略）。将扩增的目的基因分别克隆至pVAX1 中构建重组质粒pVAX1-P113-LppA，并经PCR 鉴定，结果显示，扩增出约1 100 bp 的目的条带，而空载体对照无该目的条带（图1A）；双酶切呈现两条DNA 带，即载体条带（2 999 bp）和目的条带（1 146 bp），而空载体对照仅有一条2 999 bp 条带（图1B）。进一步测序结果显示，重组质粒插入片段准确。上述结果表明重组质粒pVAX1-P113-LppA 构建正确。

图1 重组质粒pVAX1-P113-LppA PCR（A）及双酶切（B）鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasmid pVAX1-P113-LppA using PCR(A)and double enzyme digestion(B)

2.2 重组P113/LppA 蛋白表达的鉴定结果提取重组质粒pVAX1-P113-LppA 转染的MDBK 细胞总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板经PCR 鉴定，结果显示，在约700 bp和450 bp处出现目的条带，而空白对照和空载体均无该目的条带（图2），表明目的基因能在MDBK 细胞中转录。取经过空载体和重组质粒pVAX1-P113-LppA 转染48 h 的MDBK 细胞，采用IFA 方法检测目的蛋白表达情况，结果显示，重组质粒pVAX1-P113-LppA 转染后的MDBK 细胞出现特异性绿色荧光，而在pVAX1 对照组和正常细胞对照组中均未观察到特异性绿色荧光（图3）。表明构建的重组质粒可在哺乳动物细胞内分别正确表达目的蛋白。

图2 P113/LppA RT-PCR结果Fig.2 P113/LppA RT-PCR results

图3 目的蛋白表达的western blot鉴定结果（×400）Fig.3 Expression results of the target proteins（×400）

2.3 重组质粒免疫对小鼠脾淋巴细胞的影响结果

2.3.1 重组质粒对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 免疫后各组小鼠在各时间点迫杀2 只小鼠，并无菌取小鼠脾脏制备脾淋巴细胞悬液， 通过MTT 检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖情况，结果显示，pVAX1-P113-LppA 首免后7 d～49 d，小鼠脾淋巴细胞增殖能力均极显著高于Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组（P＜0.01），重组质粒pVAX1-P113-LppA 免疫小鼠的脾淋巴细胞在首免后28 d 时增殖能力最强，而后缓慢下降，整体水平呈先高后低的趋势（图4）。表明重组质粒pVAX1-P113-LppA可刺激小鼠的脾淋巴细胞增殖，增强机体的细胞免疫应答。2.3.2 各组小鼠T 淋巴细胞亚群分析结果 分别随机取首免后28 d 的各组小鼠2 只迫杀后，无菌取脾脏制备脾淋巴细胞悬液，利用流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+T 淋巴细胞占总细胞数的比例。结果显示，重组质粒免疫小鼠脾淋巴细胞CD4+T淋巴细胞的百分比为23.25%，极显著高于Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组（P＜0.01）；CD8+T淋巴细胞的百分比为10.05%，显著高于Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组（P＜0.05）（图5）。表明重组质粒免疫小鼠后能诱导小鼠CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖。

图4 各组小鼠脾淋巴细胞增殖情况检测结果（OD490nm）Fig.4 Test results of splenic lymphocyte proliferation in mice in each experimental group(OD490nm)

图5 各组小鼠T淋巴细胞CD4+、CD8+分子的表达情况Fig.5 Expression of CD4+and CD8+molecules in T lymphocytes of immunized mice

2.4 免疫小鼠血清中特异性抗体和细胞因子检测结果

2.4.1 免疫小鼠血清中特异性抗体检测结果 小鼠在免疫重组质粒后14 d 内未发现任何临床异常现象。定时采集各组小鼠血清样品，采用ELISA 法检测小鼠血清特异性抗体的分泌水平。结果显示，通过首免+加强免的方式免疫重组质粒后，小鼠血清中P113和LppA抗体水平均呈上升趋势（图6A、图6B），且在免疫7 d～49 d 内抗体水平均极显著高于Elution Buffer对照组和空载体pVAX1对照组（P＜0.01），在初次免疫后49 d 时重组质粒免疫组小鼠血清中特异性抗体水平仍为阳性。表明重组质粒pVAX1-P113-LppA 能够刺激小鼠产生较强的体液免疫应答，且免疫时效较长。

图6 各组小鼠抗体检测结果（OD630nm）Fig.6 Antibody test results of mice in each immunization group(OD630nm)

2.4.2 免疫小鼠血清中细胞因子检测结果 定时采集各组小鼠血清，利用细胞因子检测试剂盒分别检测小鼠血清IL-2、IL-4、IFN-γ 的含量。结果显示，免疫重组质粒pVAX1-P113-LppA 后，小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 的分泌水平均显著上升（图7），首免后第28 d 到达顶峰后缓慢下降，且该组小鼠血清中IL-2、IL-4 和IFN-γ 的分泌量均显著高于Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组（P＜0.05）。表明重组质粒pVAX1-P113-LppA 能刺激小鼠Th1 型细胞因子（IL-2、IFN-γ）的分泌，也能刺激小鼠Th2型细胞因子（IL-4）的分泌，进而增强小鼠免疫应答功能。

图7 小鼠血清中细胞因子分泌水平检测结果Fig.7 Test results of cytokine secretion level in mouse serum

2.5 免疫小鼠攻毒保护性试验结果

2.5.1 实验动物临床保护统计结果 对三免14 d 后各组小鼠进行攻毒保护试验，统计各组小鼠发病情况和免疫保护率。结果显示，在感染Mo 和Mmc后，Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组小鼠均出现精神沉郁、食欲减少和活动减少等发病症状；重组质粒pVAX1-P113-LppA 免疫组小鼠在感染Mo 和Mmc 后均有3 只出现精神沉郁等症状，保护率为40%（表2），而未感染支原体的小鼠均未出现任何症状。表明重组质粒pVAX1-P113-LppA 对小鼠可提供一定抗Mo 和Mmc 感染的能力。

2.5.2 免疫动物组织病理学检测结果 攻毒后14 d迫杀对照组发病小鼠和重组质粒组未发病小鼠，采集肺脏组织制备病理切片观察，结果显示，未免疫未感染小鼠肺泡结构完整，无炎症发生（图8A）；Elution Buffer 对照组和空载体pVAX1 对照组小鼠感染Mo 后肺泡结构消失，有大量炎性细胞浸润（图8B、图8C），而感染Mmc 后肺泡形成了融合性病灶，肺泡结构退化，肺泡壁断裂，有炎性细胞浸润（图8D、图8E）；重组质粒pVAX1-P113-LppA免疫组小鼠感染Mo/Mmc后肺泡结构较完整，仅有少量炎性细胞浸润（图8F、图8G）。进一步表明重组质粒pVAX1-P113-LppA 免疫小鼠后可减轻Mo/Mmc 感染引起的肺组织损伤。

图8 各组小鼠肺组织病理切片观察（HE×400）Fig.8 The lung tissue sections of the mice(HE×400)

3 讨 论

Mo 是一种能引起绵羊和山羊支原体肺炎的一种致病支原体[13]，Mmc 则仅能引起山羊患病[14]，患病羊主要表现为严重的纤维素性肺炎和胸膜炎，贵州饲养山羊以贵州地方品种为主，羊群支原体病的防控是养羊业的关键。有学者发现在猪肺炎支原体中黏附蛋白P97 蛋白能够有效引起机体免疫应答，揭示了黏附蛋白作为疫苗靶蛋白的可能性[15]，也有研究发现牛支原体膜蛋白p59 蛋白具有免疫原性，可作为亚单位疫苗研制的候选蛋白[16]。Mo P113 蛋白是一种重要的黏附分子和膜表面免疫原[17]，Mmc LppA蛋白是支原体细胞膜上重要的脂膜蛋白[18]，有研究发现Mo 贵州株P113 蛋白C 末端基因和Mmc 贵州株LppA 蛋白N 末端基因抗原性较强，可作为亚单位疫苗的候选蛋白，研究结果与黏附蛋白和脂膜蛋白具有抗原性的结果相似[19-22]。因此本研究选择Mo P113蛋白和Mmc LppA 蛋白基因相应片段，利用基因工程技术以pMD19-T-P113 和pMD19-T-LppA 质粒为模板构建了重组质粒pVAX1-P113-LppA，进行核酸疫苗初步研究。

血清特异性抗体水平是反应机体体液免疫应答水平的一个指标，IL-4 属于典型的Th2 型细胞因子，主要作用为增强免疫系统的体液免疫反应[23]，血清中特异性抗体及IL-4 分泌水平变化时则可直接反应机体的体液免疫水平。周怡等发现融合表达绵羊肺炎支原体TBP30 和Hsp70 基因可刺激小鼠分泌大量特异性抗体及IL-4，增强机体体液免疫应答[24]。本研究也发现重组质粒免疫组小鼠免疫后血清中特异性抗体及IL-4 分泌量显著升高，IL-4 含量升高可使CD4 和45RO+T 细胞向Th2 细胞转化，而且还可诱导CD4 和45RA+前体细胞分化为Th2 效应细胞，增强了小鼠体液免疫应答功能。细胞因子分泌水平、脾淋巴细胞增殖效率可作为检测机体细胞免疫应答效果的指标之一，IL-2、IL-4 和IFN-γ 是机体内的主要细胞因子，IL-2 和IFN-γ 属于典型的Th1 型细胞因子，对增强机体细胞免疫反应和抗病毒感染有着重要作用[25]。本研究发现小鼠免疫重组质粒后，血清中特异性抗体和脾细胞增殖率显著高于空载体对照组和Elution Buffer 对照组，还发现重组质粒免疫组CD4+和CD8+T 淋巴细胞的百分比高于对照组，CD4+和CD8+T 淋巴细胞的增多可促进机体分泌Th1 型细胞因子，继而增强机体细胞免疫应答功能，同时血清IL-2 和IFN-γ 的分泌水平相较于空载体对照组和Elution Buffer 对照组显著上升，本研究结果与马小静等研究结果相似[26]。本研究发现脾细胞增殖率升高使机体CD4+和CD8+T 淋巴细胞增多，使得Th1 型和Th2 型细胞因子的分泌量上升，小鼠血清IL-4 分泌水平升高可提高机体体液免疫水平，IL-4 增多可促进机体Th2 细胞向Th1 细胞转化，以保证Th1 细胞的持续分泌状态，从而增强机体细胞免疫的功能；IL-2 和IFN-γ 的分泌会使Th1 细胞的大量增殖，以提高机体免疫效力。

同时免疫小鼠攻毒保护性试验结果也显示重组质粒免疫组小鼠肺脏病变较对照组轻，仅有极少量的炎性渗出物。该结果进一步说明重组质粒能够刺激机体产生免疫应答，且对Mo 和Mmc 两种支原体感染均具有一定的抵抗力，但本研究未对免疫剂量不同是否会导致小鼠免疫应答差异进行研究，针对免疫保护率低等问题，可能与本实验中群体选择较小、未采用分离病原动物试验，以及免疫小鼠的剂量有关，对此后续需要进一步试验，以评估重组质粒的保护效果。

本研究结果首次表明P113 C 末端蛋白和LppA N末端蛋白可作为新型疫苗研发的候选蛋白，为羊支原体肺炎二价核酸疫苗的研制提供参考依据。