增强型猫ω 干扰素的筛选及抗病毒活性分析

李 茵，潘玉迪，田 进，曲连东

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069）

干扰素（IFN）是一种由细胞产生的具有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节作用的分泌性糖蛋白[1]。根据其与受体相结合的方式分为I 型、II 型和III 型（IFN-I、IFN-II、IFN-III），其中IFN-ω 与IFN-α、IFN-β 同属于IFN-I，它们可通过相同的受体（IFNAR1 和IFNAR2）发挥一定的生物活性[2]。IFN-ω 主要由白细胞产生，除了具有与IFN-α 相似的生物学特性以及类似的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节功能外，还具有一定程度的跨物种生物学活性[3]。1992 年，猫ω 干扰素（FeIFN-ω）基因首次被鉴定，1 年后重组FeIFN-ω 制剂在日本生产，主要用于治疗猫杯状病毒病及细小病毒病，并批准为抗猫杯状病毒（FCV）感染的第一个兽用抗病毒制剂[4]。王鸿宾等人对比猫IFN-ω 与猫IFN-α 及日本同类干扰素产品，发现针对水泡性口炎病毒（VSV）、FCV、犬瘟热病毒（CDV）和禽流感病毒（AIV）IFN-ω均表现出更高的抗病毒活性和广泛的细胞种属性[5]。近年来，随着国内宠物猫饲养量的大幅度增加，并且猫的多种病毒病如猫传染性腹膜炎、猫瘟、猫免疫缺陷病等对宠物猫的健康危害较为严重，以及缺乏有效的疫苗等问题，给宠物猫饲养者带来困扰[6]。因此，对高活性FeIFN-ω 治疗制剂的需求也进一步提高。

分子对接是运用计算机及相关软件，研究配体小分子和受体生物大分子之间的相互作用方式，预测其结合亲和力，从而进行药物设计的方法[7]。利用分子对接方法预测并筛选IFN与IFN授体（IFNAR1/R2）的最佳结合位点可以提高结合亲和力及IFN 活性。哺乳动物细胞表达系统具有完善的糖基化修饰功能和折叠机制，可理想地对表达的蛋白进行翻译后加工、修饰并分泌到细胞外，相对于原核、酵母及昆虫细胞等表达系统，哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白活性更接近于天然蛋白，生物学活性和安全性均明显增加[8]。慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，达到持久性表达[9]。目前，慢病毒已广泛用于构建稳定表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，生产高活性的外源蛋白[10]。

为了进一步提高FeIFN-ω 的生物活性、扩大其在临床上的应用，本研究对FeIFN-ω进行突变优化并利用293 悬浮细胞结合慢病毒转导制备突变型干扰素蛋白，经生物活性分析，筛选增强型FeIFN-ω，为研发新型、高效的抗病毒药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料pJET-FeIFN-ω 重组质粒、 猫肾（CRFK）细胞、293T 细胞、293 悬浮细胞（293s）、FCV F9 株和猫疱疹病毒（FHV）HR-1 株、慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1、包装质粒psPAX2 和膜蛋白质粒pMD2.G、IFNAR1 及IFNAR2 质粒由本实验室保存；鼠His 单克隆抗体（MAb）、兔myc 多克隆抗体（PAb）购自Abcam；山羊抗兔HRP-IgG 和山羊抗鼠HRP-IgG 购自美国LICOR 公司；BCA 蛋白测定试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；反转录试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；DH5α 感受态细胞、DNA Marker 外源蛋白、限制性内切酶XhoI 和BamH I 和T4 DNA 连接酶均购自TaKaRa 公司；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、细胞总RNA试剂盒购自AXYGEN 公司；His 标签蛋白纯化树脂购自天地人和生物科技有限公司。

1.2 引物的设计及合成根据相关文献[11]及分子对接技术对GenBank 中登录的FeIFN-ω 基因序列（NM_001102440.1）进行突变，利用软件Oligo7 设计3组定点突变引物，引物序列如表1（引物1）。在FeIFN-ω 基因序列的两端分别添加BamH I 和XhoI 酶切位点（划线部分）、保护性碱基以及在基因序列尾部添加His 标签基因序列，设计用于构建表达载体的引物，引物序列如下表1（引物2）。引物由吉林库美生物公司合成。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 FeIFN-ω突变基因的扩增、重组质粒的构建与鉴定以pJET-FeIFN-ω 质粒为模板，利用引物FeIFN-ω-156-F/R 扩增FeIFN-ω 基因、引物FeIFNω-35-F1/F2/R扩增FeIFN-ω-R35L基因、引物FeIFNω-156-F/R1/R2 扩增FeIFN-ω-A156R 基因、引物FeIFN-ω-188-F/R 扩增FeIFN-ω-T188R 基因。反应程序为：94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃1 min，35个循环；72 ℃10 min。PCR产物回收后由吉林库美生物公司测序分析。测序结果正确的FeIFN-ω、FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因片段经BamH I 和XhoI 酶切后连接至真核表达载体pLVX-IRES，构建重组质粒。并利用BamH I 和XhoI双酶切鉴定，将阳性重组质粒分别命名为pLVXFeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R。

1.4 重组质粒的慢病毒包装将293T 细胞接种于6孔板，待细胞汇合度达到80%以上，利用PEI 将4个重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R 分别与包装质粒psPAX2、膜蛋白质粒pMD2.G 共转染293T细胞进行慢病毒包装。转染48 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，鉴定后收获细胞上清，3 000 r/min离心5 min 收集上清，各2 mL 即为包装好的慢病毒。在-20 ℃暂存。

1.5 目的蛋白的表达及纯化待293s 细胞达到1×106个/mL 时，将收获的4 种慢病毒各2 mL 与1 mL 293s 细胞混匀，用293 无血清细胞培养基悬起，总体积为20 mL，用细胞摇瓶于37 ℃摇床培养6 h～8 h后换液。培养48 h 后吸取100 μL 细胞至96 孔板，在荧光显微镜下观察绿色荧光。每隔3 d，细胞以1∶2 传代至新的细胞摇瓶、并收获细胞上清，直至收获800 mL 上清液。细胞上清经镍离子亲和层析柱纯化，分别用30 mmol/L 咪唑、250 mmol/L 咪唑洗脱后，经SDS-PAGE 鉴定，BCA 蛋白浓度测定后分装， -80 ℃保存备用。将获得的4 个重组蛋白即重组干扰素分别命名为rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。

1.6 重组干扰素活性的测定

1.6.1 荧光定量PCR 引物的设计与合成 荧光定量PCR 引物由本实验室保存（表2）。

表2 荧光定量PCR引物序列Table 2 Primers used for real-time PCR

1.6.2 重组干扰素抗病毒活性的分析 在2 个24 孔板均铺104个CRFK 细胞，待细胞长满后，分别加500 μL 浓度为2 μg/mL 的4 个重组干扰素，空白对照不加干扰素，各3 个复孔。孵育18 h 后，2 个细胞板分别接种FCV（MOI 0.1）和FHV（MOI 0.1）[12]，12 h后分别提取细胞总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，分别采用引物FCV-F/R、FHV-F/R、18s rRNA-F/R，经荧光定量PCR 在RNA 水平检测病毒的基因拷贝数，程序为：95 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃20 s，共40 个循环；设定溶解曲线：95 ℃15 s，60 ℃1 min，75 ℃15 s。以18s rRNA 为内参基因，分析4个重组干扰素的抗病毒活性。

1.6.3 重组干扰素诱导ISGs 转录活性的分析 在24孔板铺104个CRFK 细胞，待细胞长满后，分别加500 μL 浓度为2 μg/mL 的4 个重组干扰素，空白对照不加干扰素，各3 个复孔。孵育12 h 后分别提取细胞总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，分别采用引物ISG15-F/R、Viperin-F/R、IFITM1-F/R、18s rRNA-F/R，经荧光定量PCR 检测细胞中的干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 的mRNA 水平，程序为：95 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃20 s，共40 个循环；设定溶解曲线：95 ℃15 s，60 ℃1 min，75 ℃15 s。以18s rRNA 为内参基因，分析4个重组干扰素对干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 表达量的影响。

1.6.4 重组干扰素与干扰素受体结合亲和力的分析采用Pull-down 方法检测rFeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R与干扰素受体IFNAR1 和IFNAR2 的结合亲和力。将293T 细胞接种于6 孔板中，待细胞汇合度达到80%，分别用PEI 转染IFNAR1、IFNAR2 质粒[13]，各2 个复孔，48 h 后各加入2 mL 细胞裂解液裂解细胞。取100 μL浓度为200 μg/mL的重组干扰素rFeIFNω 和rFeIFN-ω-T188R 分别与100 μL His 纯化树脂结合3 h，均加入1 mL 的IFNAR1 和IFNAR2 细胞裂解液，4 ℃结合过夜，对照组不加干扰素。经1×PBST 洗涤3 遍，9 000 g 室温离心3 min；弃PBST 上清液，各加80 μL 1×PBS、20 μL 5×SDS-PAGE Buffer，以鼠源His MAb（1∶1 000）为一抗，山羊抗鼠HRP-IgG（1∶15 000）为二抗，通过western blot 检测rFeIFN-ω 和rFeIFN-ω-T188R 的表达情况；以兔myc PAb（1∶1 000）为一抗，山羊抗兔HRP-IgG（1∶8 000）为二抗，通过western blot 检测IFNAR1/R2 的表达情况。

2 结 果

2.1 突变FeIFN-ω基因的扩增、重组质粒的构建与鉴定以pJET-FeIFN-ω 质粒为模板，PCR 扩增FeIFN-ω、FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因，分别经BamH I 和XhoI 酶切，连接至慢病毒载体pLVX-IRES，构建重组质粒pLVXFeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R，经双酶切及测序鉴定。结果显示，获得与预期612 bp 大小相符的目的基因（图1）。基因序列比对结果显示均在相应氨基酸位点出现碱基突变（图2）。表明正确构建了重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVXFeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R。

图1 重组质粒双酶切鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

图2 重组质粒基因测序结果Fig.2 Sequencing of recombinant plasmid gene

2.2 重组质粒的慢病毒包装重组质粒pLVX-FeIFNω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R 分别转染293T 细胞48 h 时，在荧光显微镜下观察，均可见大面积的绿色荧光（图3）。表明获得了分别包装有FeIFN-ω、FeIFNω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因的慢病毒。

图3 重组质粒转染48 h的293T细胞中GFP表达情况Fig.3 The expression of GFP in 293T cells transfected by recombinant plasmid for 48 h

2.3 目的蛋白的表达及纯化收获的P10 代各慢病毒转导293s 细胞48 h 时在荧光显微镜下观察，均可见大面积的绿色荧光（图4），表明各慢病毒均导入293s 细胞中。收获的细胞上清分别利用镍离子亲和层析柱纯化蛋白，经SDS-PAGE 鉴定，结果显示，分别获得约20 ku 目的蛋白（图5），与预期大小均相符。BCA法测rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R蛋白浓度分别为188 μg/mL、255 μg/mL、160 μg/mL、178 μg/mL，表明上述4 个重组干扰素蛋白在293s 细胞中均得到高效表达。

图4 293s细胞转导慢病毒P10代的GFP表达情况Fig.4 The expression of GFP 293s cells transfected with Lv-eGFP of P10

图5 重组干扰素蛋白的SDS-PAGE鉴定Fig.5 Identification of recombinant interferon by SDS-PAGE

2.4 生物活性检测结果

2.4.1 重组干扰素的抗病毒活性 采用相对荧光定量PCR 法检测4个重组干扰素对FCV和FHV的复制的抑制作用，结果显示：与空白对照组相比，差异极显著，实验组病毒复制水平均显著降低（P＜0.01），实验组中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 与rFeIFN-ω差异不显著（P＞0.05），rFeIFN-ω-T188R 与rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 相比病毒的复制均降低，并且rFeIFN-ω-T188R 抑制FCV 和FHV 复制的能力均比rFeIFN-ω 增强1 倍左右（图6）。表明4个重组干扰素中rFeIFN-ω-T188R 的抗FCV 和FHV活性最高。

2.4.2 重组干扰素诱导ISGs 转录水平的检测 采用相对荧光定量PCR 法检测重组干扰素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R分别诱导ISG15、Viperin、IFITM1 的转录活性。结果显著：与空白对照组相比，实验组4 个重组干扰素诱导的上述4 个基因的转录水平均上调，实验组中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 与rFeIFN-ω差异不显著（P＞0.05）或显著下调（P＜0.05），rFeIFNω-T188R 与rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 相比均显著上调（P＜0.05），并且rFeIFN-ω-T188R 诱导ISG15、Viperin、IFITM1 的转录水平均比rFeIFN-ω 高1 倍左右（图7）。表明4 个重组干扰素中rFeIFN-ω-T188R 诱导干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 的转录活性最强。

图7 重组干扰素在CRFK细胞诱导Viperin（A）、ISG15（(B）和IFITM1（C）mRNA转录水平的测定Fig.7 Viperin(A),ISG15(B)and IFITM1(C)levels induced by recombinant interferon in CRFK cells

2.4.3 重组干扰素与干扰素受体结合亲和力 通过比较western blot 蛋白条带灰度值，分析rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-T188R 与IFNAR1 和IFNAR2 的亲和力。结果显示，rFeIFN-ω-T188R 与干扰素受体IFNAR1 的结合能力比rFeIFN-ω 高1 倍左右（图8），而两者与干扰素受体IFNAR2 的亲和力差异不显著。结果表明rFeIFN-ω-T188R 的突变增强了FeIFN-ω 与其受体IFNAR1 的结合亲和力。

图8 rFeIFN-ω 和rFeIFN-ω-T188R与干扰素受体IFNAR1/2亲和力的western blot 鉴定（A）结果及蛋白条带灰度值分析（B）结果Fig.8 Western blot identification of rFeIFN-ω and rFeIFNω-T188R affinity with IFNAR1/2(A)and protein band density value analysis(B)result

3 讨 论

近年来，干扰素因其高效且广谱的抗病毒作用被广泛的作为抗病毒药物应用于临床治疗。目前已知的FeIFN-ω 及其基因工程制品大多在大肠杆菌载体中表达，但大肠杆菌表达的干扰素多以包涵体形式存在，操作过程复杂且蛋白产物活性低[14]。哺乳动物细胞表达系统克服了原核表达系统的缺点，且具有完善的糖基化修饰功能和折叠机制，可对表达的蛋白进行翻译后加工、修饰并分泌到细胞外[15]。利用慢病毒载体介导外源基因进入细胞，具有表达效率高、安全性高、免疫原性低等优势，从而实现目的蛋白的持久、稳定表达[16]。

本研究室前期实验比较了真核与原核表达的野生型FeIFN-ω 生物活性，结果显示哺乳动物表达系统表达的干扰素抗病毒活性高于原核表达。目前，基于分子对接的计算机筛选技术在研制新药方面应用十分广泛，近期罗才荣等人利用分子对接技术成功筛选了一种高效的抗炎活性生物碱[7]。本研究通过分子对接方法预测和参考黄丽等对猪干扰素的相关研究对FeIFN-ω 氨基酸序列进行点突变[11]，选择了3 个突变点R35L、A156R、T188R。利用慢病毒载体pLVX-IRSE 分别介导FeIFN-ω、FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R 基因进入293T 细胞，在293T 细胞中成功包装慢病毒后转导293s 细胞，在293s 细胞高效表达了rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。在一些国内外的报道中，293s 细胞是最常用的生产高滴度慢病毒的悬浮培养细胞，吴全德等利用悬浮培养的293s 细胞生产重组腺病毒载体Ad-IFNγ，并取得了良好的效果[17]。本实验通过生物活性检测分析，在CRFK 细胞中4 个重组干扰素均发挥了一定的抗病毒作用，其中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 与rFeIFN-ω 相比，抗FCV 和FHV 活性及诱导干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1 的转录活性均无明显增强，并且个别呈现降低趋势。相关研究表明某些位点的突变会破坏干扰素与干扰素受体结合的稳定性，缩短诱导干扰素的持续时间，使二者结合的亲和力降低，生物活性也相应的减弱[18]。因此，本研究选择抗FCV 和FHV 活性及诱导ISGs 转录活性均增强的rFeIFN-ω-T188R 进一步检测其与干扰素受体的结合情况，结果显示，T188R 突变促进了FeIFN-ω 与其受体IFNAR1 的结合，提高了ISGs 的表达量，增强了FeIFN-ω 的抗病毒活性。可能是此位点的突变使FeIFN-ω 诱导的持续时间延长，能与细胞表面受体长时间的紧密结合，从而发挥更强的抗病毒作用[18]。

本研究获得了相对于野生型FeIFN-ω 抗病毒、诱导ISGs 表达等活性均显著提高的增强型猫ω 干扰素FeIFN-ω-T188R，为进一步研制高效的抗病毒制剂和免疫增强剂提供参考依据和研究手段。