中国与美国RFLP 1-4-4 lineage1C 变异株同一分支PRRSV 的全基因组序列分析

许 浒，李 超，相丽润，汤艳东，赵 静，龚帮俊，李宛生，付 军，彭金美，王 倩，周国辉，冷超粮，安同庆，蔡雪辉*，张洪亮*，田志军*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150069；2.南阳师范学院，河南 南阳 473061）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征的主要病原，给养猪业造成了重大的经济损失。该病毒分为欧洲型和美洲型两个基因型[1]。2006 年以前中国大陆的主要流行株是以CH-1a 为代表的经典PRRSV，2006 年高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在我国出现并迅速成为了我国的主要流行株，该类病毒Nsp2 蛋白中存在30（1+29）个氨基酸的不连续缺失[2]。2012 年我国报道了类NADC30 PRRSV，该类病毒Nsp2蛋白中存在131（111+19+1）氨基酸的不连续缺失[3]，该类病毒具有同源性低、重组频繁和致病性差异较大的特点，已经逐渐成为我国主要的流行株[4]。

2014 年ORF5 RFLP 1-7-4 谱系PRRSV 毒株在美国出现并流行，至少在美国5 个生猪生产洲检测到该类病毒，其在母猪群中引起严重的流产，并导致了仔猪的高死亡率[5]。2017 年本实验室从辽宁省两个发病猪场首次检测到1-7-4 分支PRRSV[6-7]。中国1-7-4 分支病毒株在Nsp2 区均存在100 个氨基酸连续缺失，这与美国1-7-4 分支病毒株相同[8]。由于中国的1-7-4 分支病毒株与美国的IA/2014/NADC34 株较为相似，因此也称为类NADC34 PRRSV[9]。2020 年美国报道了一种高致病性的美洲型PRRSV，并命名为ORF5 1-4-4 Lineage 1C 变异株，其对猪的致死率可达17.50%[10]。然而该类病毒株与1-7-4 谱系PRRSV（即类NADC34 PRRSV）同源性最高，那么当下我国类NADC34 PRRSV 的流行情况是怎样的，美国1-4-4 Lineage 1C 变异株与我国类NADC34 PRRSV之间存在着怎样的关系？本实验将就此展开研究。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源及主要试剂722 份疑似PRRSV感染的病料组织或血清样品为本实验室2020 年～2021 年6 月采自13 个省、市和自治区（黑龙江省、内蒙古自治区、吉林省、辽宁省、河北省、山西省、山东省、河南省、湖北省、四川省、江西省、新疆自治区、天津市）的规模化养猪场。RNeasy plus Mini Kit 购自Qiagen 公司；M-MLV 反转录酶、dNTPs、LATaqDNA 聚合酶和pMD18-T 载体等均购自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 购自OMEGA 公司；TG1 感受态细胞由本实验室制备。

1.2 引物设计根据GenBank中的NADC30（JN654459）和IA/2014/NADC34 株（MF326985）全基因组序列，参照文献[6]由库美生物有限公司合成2 对检测引物和8 对全长扩增引物。

1.3 PRRSV 部分基因及全基因序列扩增按常规方法处理收集的组织或血清样品，利用RNeasy plus Mini Kit 提取总RNA，反转录制备cDNA 为模板，利用2 对检测引物对病料样品检测并扩增Nsp2 和ORF5 基因。阳性样品扩增产物由库美生物有限公司测序分析后，选取类NADC34 PRRSV 阳性样品的cDNA 为模板，利用8 对全长引物扩增全基因组序列。PCR 反应程序为，94 ℃2 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s～2 min 30 s，共30 个循环；72 ℃10 min。采用Gel Extraction Kit 对目的片段纯化，并将纯化的PCR 产物克隆至pMD18-T 载体，PCR 鉴定阳性重组质粒由库美生物有限公司进行测序。全基因组序列采用MegAlign和Seqman拼接。

1.4 PRRSV 的同源性分析及推导氨基酸序列分析利用MegAlign（ClusterW）对类NADC34 PRRSV 及美国RFLP 1-4-4 lineage1C 变异株的全基因组进行核苷酸序列的同源性分析及Nsp2 基因推导氨基酸序列的分析。

1.5 PRRSV 的遗传演化分析利用MEGA6.0（Neighbor-Joining method，bootstrap 值为1000）对类NADC34 PRRSV、美国RFLP 1-4-4 lineage1C 变异株及Gen-Bank 中的PRRSV 参考序列进行全基因组、Nsp2 部分基因序列和ORF5 基因的遗传演化分析。

1.6 PRRSV 的全基因组重组分析根据GenBank 中登录的PRRSV 参考序列，利用RDP4 和Simplot 软件对分离株进行重组分析，筛选出主要亲本毒株和次要亲本株，利用Simplot 软件绘制重组图。着重对PRRSV ORF5 基因进行RFLP 模式分析。

2 结果与讨论

2.1 2020 年～2021 年类NADC34 PRRSV 检测结果对722 份猪组织或血清样品进行PCR 检测，结果显示PRRSV阳性样品359份，扩增产物经测序分析后发现其中类NADC34 PRRSV 样品32 份。为了进一步探究该类病毒株的流行特点及基因组序列变化，本实验选取了5 份（HLJTZJ829、HLJTZJ864、HLJTZJ921、LNT ZJ1341、SDHSW135）样品进行了全基因组序列测定。

本实验室在早期研究中对2020 年以前报道的类NADC34 PRRSV 株进行综合分析，推测其是我国潜在的流行株[9]。自2017 年本实验室首次报道该类毒株[7]至2019 年底中国共报道了14 株类NADC34 PRRSV[9,11-12]，远低于2020 年以来的检出数量。尽管本研究检测的样品数量和区域相对有限，但分析可见近年来类NADC34 PRRSV 检出数量在PRRSV 阳性检出数量中占比有所增加，加大对该类病毒株的重视已迫在眉睫。

2.2 遗传演化分析本研究对类NADC34 PRRSV 和美国新发1-4-4 变异株的全基因组、Nsp2 和ORF5基因进行遗传进化树的构建。基于全基因组和Nsp2部分基因序列的遗传演化结果显示，美国RFLP 1-4-4 lineage 1C变异株与所有类NADC34 PRRSV均属于Sublineage 1.5 亚型，因此美国新发RFLP 1-4-4 lineage 1C 变异株与类NADC34 PRRSV 属于同一亚型（图1）。基于ORF5基因遗传演化分析结果显示，我国类NADC34 PRRSV HLJZD22-1812、LNWK96 与RFLP 1-4-4 lineage 1C 均为Sublineage 1.8 亚型（NADC30-like），均是由病毒基因组序列发生重组导致（图1）。

2.3 Nsp2 推导氨基酸序列的分析结果Nsp2 是PRRSV 全基因组中变异最大的区域之一，Nsp2 区域的基因缺失、插入或突变常被作为区分不同类型毒株的分子标记。本研究利用MegAlign 对中国和美国的类NADC34 PRRSV 及美国新发RFLP 1-4-4 lineage1C 变异株的Nsp2 推导氨基酸序列进行比对，结果显示，24 株类NADC34 PRRSV、RFLP 1-4-4 lineage 1C 变异株与参考株ATCC VR2332 相比，均具有100 个按基酸（aa328～aa427）的连续缺失（图1D）。我国的类NADC34 PRRSV 与美国RFLP 1-4-4 lineage 1C PRRSV 变异株具有一致的缺失特征。

图1 类NADC34 PRRSV及RFLP 1-4-4 lineage 1C变异株分别基于全基因组（A）、Nsp2（B）、ORF5（C）基因序列的系统进化树;类NADC34 PRRSV及美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株Nsp2推导氨基酸序列比对（D）Fig.1 A phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of the whole genome(A),ORF5(B),and Nsp2(C)genes of NADC34-like PRRSV and 1-4-4 lineage 1C variants.Alignments of NADC34-like PRRSVs and RFLP 1-4-4 lineage 1C variants based on deduced amino acid sequences of Nsp2（D）

2.4 病毒全基因组重组分析结果近年来，有关PRRSV 重组病毒株的报道层出不穷，尤其类NADC30株进入我国后迅速与我国本土病毒株重组，逐渐成为主要流行株[4]，其已展现出极其复杂的致病性。本研究利用RDP4 和Simplot 生物学软件对我国新发类NADC34 PRRSV（HLJTZJ829、HLJTZJ864、HLJTZ J921、LNTZJ1341、SDHSW135）及美国RFLP 1-4-4 lineage 1C 变异株的全基因组序列进行对比分析，结果显示，美国RFLP 1-4-4 lineage 1C 变异株病毒的基因重组区域位于1 nt～11 681 nt（IA14737-2016）、11 682 nt～13 921 nt（IA/2014/NADC34）和13 922 nt～15 058 nt（NADC30）（图2），以上结果表明美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 变异株是以IA14737-2016（类NADC34 PRRSV）为母本毒株，IA/2014/NADC34 和NADC30 株提供重组片段的重组病毒。进一步对比分析可见美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国病毒株HLJZD22-1812（MN648450）重组模式非常相近，二者均由类NADC34 病毒株提供骨架，并在ORF5 区域与NADC30 毒株重组（图2）。

图2 RFLP 1-4-4 lineage 1C variant重组分析Fig.2 Recombination analysis of RFLP 1-4-4 lineage 1C variant

与早期报道的类NADC34 株不同，本团队近期检测到的类NADC34 株均未发生重组，并且早期报道的类NADC34 株的重组片段也均由美国株提供，类NADC34 PRRSV 在我国尚未与本土毒株发生重组。推测类NADC34 PRRSV 未与本土毒株重组可能是其在我国致病性整体较弱[8,13]，且未爆发性流行的原因之一。

2.5 PRRSV ORF5 分析限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析主要是依据MluI、Hind II 和SacII 在ORF5 基因上的酶切模式进行划分[14]。RFLP模式分析结果显示，我国类NADC34株的RFLP模式较为复杂，主要为1-7-4模式[1（MluI=0）、7（HindII=nt88、 219、360）和4（SacII=nt24、555）]。其中HLJZD22-1812 和美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 变异株均为以类NADC34 株为骨架，以NADC30提供重组片段的重组病毒，二者ORF5 RFLP 模式均为1-4-4 模式[1（MluI=0）、4（HindII=nt88、219）和4（SacII=nt24、555）]（表1），基于ORF5的遗传演化分析结果显示HLJZD22-1812 也属于lineage1C PRRSV 分支。然而RFLP 1-4-4 模式和lineage1C 仅能展现PRRSV 的ORF5 基因特征，无法反映PRRSV 的全基因组信息，而且RFLP 1-4-4 模式的PRRSV 在lineage8、sublineage1.5 和sublineage1.8 分支中均存在[15]。

表1 类NADC34 PRRSV重组分析及RFLP模式分析Table 1 Recombination and RFLP analysis of NADC34-like PRRSV strains

本研究通过全基因组综合分析发现，RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 变异株与中国的类NADC34株均具有100 个氨基酸的连续缺失特征，基于全基因组的遗传演化分析结果发现两者均属于类NADC34 PRRSV。

综上所述，美国RFLP 1-4-4 lineage1C PRRSV 变异株与我国类NADC34 PRRSV 属于同一亚型分支（Sublineage 1.5），其分子特征是Nsp2 基因区域存在相同的100 个氨基酸连续缺失。由于类NADC34 PRRSV 已成为美国主要流行株。因此，类NADC34 PRRSV 有可能成为我国PRRSV 的潜在流行株，其流行病学及生物学特性需要进一步研究。