猪鼻支原体表面可变脂蛋白VlpB黏附宿主细胞功能研究

胡永婷，张必雄,，王 佳，冯志新，邵国青,3，熊祺琰*

(1.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801；2.江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014；3.肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京210095)

猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)是一种猪场感染率很高的人兽共患性疾病病原，可引起感染猪的多发性浆膜炎、关节炎、肺炎、中耳炎等[1-3]，并可与多种病原共感染，加重疫情，给养猪业造成较大经济损失。近年来多项研究显示M.hyorhinis与人类多种癌症的发生有明显相关性[4-6]，对人类的健康构成潜在威胁。

支原体感染的前提是黏附，因此深入研究M.hyorhinis的黏附因子对阐释其致病机制和研究疫病防控措施均具有重要意义。本团队在前期研究中证实可变脂蛋白(Variable lipoprotein，Vlp)家族为其黏附因子之一[7-9]。Vlp家族共有7个成员，分别为VlpA、VlpB、VlpC、VlpD、VlpE、VlpF和 VlpG，全部成员均具有黏附细胞能力。7个成员有着类似的分子结构(图 1)：Ⅰ区为信号肽区；Ⅱ区主要由不带电荷的氨基酸组成，各成员序列间有一定的保守性；Ⅲ区为一个“数目可变串联重复区”(Variable number of tandem repeats，VNTR)，各成员间序列各不相同，且重复序列的重复次数在不同菌株或不同代次间有很大的差异性[10]。在前期研究基础上本研究对M.hyorhinisVlpB的黏附功能展开深入研究，包括对其不同区段的黏附能力检测，以及Ⅲ区重复序列重复次数的变化对其黏附功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料猪气管上皮细胞(Swine tracheal epithelial cells，STEC)由上海抚生实业有限公司提供。VlpB阳性血清为江苏省农业科学院兽医所自制；细胞膜蛋白质和细胞质蛋白质抽提试剂盒以及BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天股份有限公司；鼠抗硫氧还蛋白单克隆抗体(MAb)、鼠抗HiS标签单抗，羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG-FITC均购自金斯瑞生物科技有限公司；短肽的合成及偶联由Synpeptide有限公司完成。PCR各种试剂、T4 DNA连接酶、DNA和蛋白Marker均购自TaKaRa公司。

1.2 细胞培养STEC(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的1640培养基)培养至融合率达到90%以上时，利用胰蛋白酶消化后稀释至2×105个/mL，接种96孔细胞培养板，每孔100 μL，于 5%CO2、37℃培养 24 h。

1.3 VlpB黏附细胞能力的检测利用细胞培养液将本实验室前期构建的VlpB蛋白[7](Ⅲ区重复序列重复次数为 6，以下称为 VlpB6)稀释至 50 μg/mL，加入接种有 STEC的 96孔板中，100 μL/孔，37℃孵育1 h，设置相同浓度的pET-32a(+)空载体作为对照。洗涤后冰乙醇固定30 min，5%BSA 4℃封闭过夜，以鼠抗硫氧还蛋白MAb(1∶2 000)为一抗，羊抗小鼠IgG-FITC(1∶500)为二抗，进行IFA检测，同时利用激光共聚焦显微镜观察分析(其中激光共聚焦显微镜观察时用DAPI染核)。在黏附抑制试验中，将 50 μg/mL VlpB6 先与 VlpB 阳性兔血清(1∶10)混合于37℃孵育1.5 h，其余同上试验。

同时，参考文献[9]，利用微孔板黏附试验对其黏附能力和黏附抑制能力进行量化检测。

1.4 含vlpBⅡ区基因的重组质粒的构建VlpB仅含Ⅱ区不含Ⅲ区的重组蛋白(即Ⅲ区重复片段重复次数为0)以下简称VlpB0，其结构见图1。根据Gen-Bank中登录的M.hyorhinis(HUB-1株，CP002170.1)vlpB的基因序列，合成vlpBⅡ区基因(两端分别添加HindⅢ和EcoRⅠ位点)，同时进行E.coli偏爱密码子的优化。vlpBⅡ区基因通过HindⅢ/EcoRⅠ酶切后克隆至载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET-32a(+)/vlpB0，转化E.coliBL21感受态细胞，挑取阳性克隆菌落进行PCR筛选，并通过测序鉴定所获得的序列的正确性，命名为vlpB0。

图1 vlpB结构和本研究中使用的蛋白结构示意图Fig.1 Structure of vlpB and the proteins used in the present study

1.5 VlpBⅢ区重复片段的合成与偶联化学合成VlpB蛋白III区重复片段短肽，重复2次，在其N端添加一个用于偶联KLH的半胱氨酸，命名为PepVlpB(NH2-CGTGSDSQDSGAKGTGSDSQDSGAKCOOH)。经高效液相色谱纯化后，短肽的纯度大于85%。将短肽与KLH按1∶1质量比偶联，获得偶联蛋白KLH-PepVlpB。

1.6 含VlpBⅢ区重复片段重复次数不等的系列重组质粒的构建根据GenBank中登录的vlpB的基因序列，设计Ⅲ区重复次数分别为3、6(前期研究已构建)、9、12次的重组蛋白基因序列，插入pET-32a(+)载体中构建pET-vlpBn，经诱导表达得到相应重组蛋白，命名为VlpBn(n代表3、6、9、12次重复)，其结构见图1，构建方法同VlpB0。

1.7 重组蛋白的表达、纯化及鉴定取重组工程菌37℃培养至 OD630nm值达到 0.6～0.8时加入终浓度为1 mol/L的IPTG诱导表达，5 h后收集菌液。超声破碎后于4℃ 9 000 r/min离心20 min，收集上清液，利用镍柱进行纯化。利用抗His标签鼠MAb(1∶8 000)为一抗，羊抗鼠 IgG-HRP(1∶5 000)为二抗，western blot鉴定重组蛋白VlpBn的表达。

1.8 微孔板黏附试验定量检测各VlpB黏附细胞能力参照文献[9]，利用微孔板黏附试验检测VlpBn的黏附细胞能力，并分析其粘附功能区域及III区重复次数对VlpB粘附能力的影响。将重组蛋白VlpBn或多肽偶联物KLH-PepVlpB用1%BSA稀释至特定浓度(在不同vlpBn比较时选择等摩尔比以避免等质量比各蛋白摩尔浓度不等带来的黏附差异影响)，并设置相同浓度梯度的空载体蛋白或KLH蛋白作为对照，每孔加入各待检样品的100 μL，在 37℃黏附1.5 h后洗涤。

1.9 统计学分析利用SPSS 23.0统计软件对实验得到的各组数据进行单因素方差分析，当p＜0.05时表示差异显著，当p＜0.01时表示差异极显著，具有统计学意义。

2 结果

2.1 vlpB黏附细胞能力检测利用本实验室前期已构建的VlpB6验证VlpB的黏附细胞能力。结果显示，VlpB可黏附STEC，加入VlpB阳性兔血清预先孵育后，其黏附力显著下降。由激光共聚焦显微镜观察可见，VlpB可以结合在整个细胞的细胞膜上，加入VlpB阳性兔血清预先孵育后，其黏附力被显著抑制(图2)。

图2 显微镜观察VlpB黏附STECFig.2 Observation of the adhesion of VlpB to STEC by microscope

微孔板黏附试验结果显示VlpB可黏附STEC，并呈现剂量依赖性(图3A)。加入其阳性血清预孵育后，黏附力显著降低(p＜0.01)，而阴性血清抑制不明显，表明VlpB对STEC具有特异性的黏附能力(图 3B)。

2.2 vlpBⅡ区重组质粒和Ⅲ区重复片段重复次数不等的系列vlpB重组质粒的构建、表达、纯化与鉴定构建Ⅲ区重复次数不等的一系列vlpB重组质粒pET-vlpn，其重复次数n分别为0(即仅含Ⅱ区重组蛋白)、3、6、9、12次。对阳性转化菌落分别提取质粒进行PCR鉴定，结果显示各PCR产物大小与目的片段一致(图4)，测序结果正确，分别命名为VlpBn(n代表不同重复次数)。

IPTG诱导重组蛋白VlpBn表达，并利用镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE检测结果显示所有重组蛋白均能有效表达，纯度均在80%以上(图5)。上述蛋白经透析浓缩后，进行western blot鉴定显示，获得的各重组蛋白条带大小均与预期相符(图6)，表明构建表达了VlpB各目的蛋白。

图3 微孔板黏附试验检测VlpB黏附STECFig.3 Detection of the adhesion of VlpB to STEC cells by the microplate adhesion test

图4 重组表达质粒pET-vlpBn的PCR鉴定Fig.4 Identification of the recombinant expression plasmids of pET-vlpBn by PCR

图5 重组蛋白VlpBn表达纯化的SDS-PAGE检测Fig.5 Detection of the expressed and purified recombinant VlpBn proteins by SDS-PAGE

2.3 VlpB黏附细胞功能区域初步鉴定利用仅含Ⅱ区的重组蛋白VlpB0和Ⅲ区重复片段鉴定VlpB分子黏附细胞的功能区域。微孔板黏附试验结果显示，Ⅲ区重复片段多肽的偶联蛋白KLH-PepVlpB可以黏附STEC(图7)，表明VlpB的Ⅲ区含有黏附表位，但呈一定剂量依赖性，当浓度超过100 μg/mL时，KLH-PepVlpB黏附能力不再明显升高。仅含Ⅱ区的重组蛋白VlpB0也可黏附STEC(图8)，且呈现明显剂量依赖性，表明VlpB的Ⅱ区也含有黏附表位。

图6 重组蛋白VlpBn的western blot鉴定Fig.6 Identification of the recombinant VlpBn proteins by western blot

图7 微孔板黏附试验检测KLH-PepVlpB偶联蛋白对STEC的黏附Fig.7 Identification of the cytoadhesion of KLH-PepVlpB by the microplate adhesion test

2.4 Ⅲ区重复次数对VlpB黏附细胞能力的影响对所构建的Ⅲ区重复次数不等的5种VlpBn重组蛋白进行黏附能力比较，利用SPSS23.0软件对各组数据进行单因素方差分析，结果显示，与空载体蛋白相比VlpB0、3、6、9、12均可黏附 STEC，且均呈现明显的剂量依赖性。与VlpB0相比，VlpB 3、6、9、12蛋白的黏附能力均明显降低，且总体而言Ⅲ区重复次数越多，黏附能力越小(图8)。推测可能III区重复会影响到其黏附位点的暴露，从而导致其黏附能力随III区重复次数增多而降低。

图8 微孔板黏附试验检测重组蛋白VlpBn的黏附细胞能力Fig.8 The cytoadhesion detection of the recombinant VlpBn proteins by microplate adhesion test

3 讨论

目前研究认为支原体一般不含有典型的毒力因子，而是通过长期的持续性感染引发宿主机体慢性炎症应答而导致病变的发生。黏附细胞是支原体感染的第一步，因此黏附因子在支原体感染致病的过程中起着非常重要的作用。但M.hyorhinis黏附因子的研究尚处于起步阶段，Kornspan首先指出介导M.hyorhinis黏附细胞的相关因子应该是位于细胞膜上的脂蛋白[11]。本团队在前期研究中证明可变脂蛋白Vlp家族为其黏附因子之一[7-9]，为首个报道的M.hyorhinis黏附因子。

支原体可变蛋白家族在许多致病性的支原体中普遍存在，其基因编码大容量的可变抗原库使得菌体表面的抗原性发生变化，是支原体有效逃避宿主的免疫系统、实现在宿主体内持续感染和增殖的重要工具。除介导免疫逃逸外，可变蛋白还同时具有其它生物功能。在多种支原体中显示可变蛋白具有黏附细胞能力，包括鸡毒支原体表面可变蛋白pMGA[12]、牛支原体的表面可变脂蛋白Vsps[13]、人型支原体的表面可变脂蛋白vaa[14]。

M.hyorhinis可变脂蛋白Vlp家族共有7个成员，前期研究证明其均具有黏附细胞能力[8]。本研究主要对VlpB的黏附特性进行深入研究。首先将成熟VlpB分为Ⅱ区和Ⅲ区分别研究其是否含有黏附位点，结果显示仅含Ⅱ区的重组蛋白VlpB0和由Ⅲ区重复肽段偶联KLH的偶联蛋白KLH-PepVlpB均可黏附STEC，表明VlpB的Ⅱ区和Ⅲ区均含有黏附位点。这与VlpA的情况不同，前期张必雄发现vlpA的Ⅲ区重复肽段不含黏附位点，仅Ⅱ区具有黏附功能[9]，可能不同的Vlp成员之间含黏附位点的情况存在差异。

Vlp蛋白的Ⅲ区为重复片段区，由长度为12或13个氨基酸的肽段串联重复组成，通过基因片段的插入和缺失，其重复次数可以发生高频率变异，在不同的菌株或不同的代次之间重复次数各不相同，导致Vlp产物的大小发生高频变化，这一变化也被认为是免疫逃逸的一种机制[10]。具有数目可变串联重复序列特征的蛋白，其重复区重复次数往往会影响蛋白功能。Costa在研究中发现重复区重复次数多的胃上皮细胞受体蛋白分子能更好地与幽门螺杆菌结合[15]；Macintosh等构建了含不同长度B重复片段区的表皮葡萄球菌表面蛋白(Aap)的基因，观察其对角质层细胞的黏附能力，结果显示，随着表皮葡萄球菌表面蛋白B区重复次数的增加其黏附细胞能力呈现增强的趋势[16]；M.hyorhinis重要的黏附因子P97蛋白的重复片段R1区的重复次数也与其黏附能力有关[17]。因此，在本研究研究了Ⅲ区重复次数变化对VlpB分子黏附功能的影响，结果显示，仅含Ⅱ区的VlpB0黏附能力最强，在等摩尔反应体系中与VlpB0相比，VlpBn整体分子的黏附能力随着Ⅲ区重复次数的增加而降低，提示Ⅲ区的黏附能力可能相对较弱，当重复次数增加时Ⅲ区增大，可能从空间上影响了Ⅱ区强黏附位点的暴露性从而导致整体分子黏附力下降。KLH-PepVlpB浓度达到饱和后黏附水平明显低于VlpB0也可从侧面支持这一推测。Citti曾经报道M.hyorhinis抵抗抗体生长抑制的能力与所表达Vlp的Ⅲ区重复次数有关，作者推测其可能的原因是重复次数增加使得Ⅲ区增大，影响了支原体膜上敏感位点的表面可及性[18]，该研究结论与本研究结果有一定的共同性。Vlp脂蛋白前体通过信号肽酶切割后得到N端为半胱氨酸的成熟蛋白，通过半胱氨酸残基连接脂质基团形成脂蛋白，再通过脂质基团锚定到细胞膜上，因此从分子特征上分析，VlpB的Ⅱ区应该位于相对近膜的表面，而Ⅲ区则可能位于外侧，Ⅲ区大小的变化可能对内侧蛋白或区段形成遮挡，这进一步提示Vlp的长度变异可能通过影响支原体表面不同位点的暴露性而影响其包括黏附在内的多方面生物学特性。但该推测需要更多的实验来证明。

本研究证实了M.hyorhinis表面的可变脂蛋白家族成员之一VlpB参与介导M.hyorhinis黏附宿主细胞，其Ⅱ区和Ⅲ区均含有黏附表位，并发现整体分子的黏附能力随着Ⅲ区重复次数增加而降低，该实验结果将有助于对M.hyorhinis的黏附及其致病机制的进一步研究。