具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

李 印，邓国华，王桂芹，杨焕良，乔传玲，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)

猪流感是由A型流感病毒中的猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)所引起的猪的一种急性、高度传染性呼吸道疾病。临床特点为急性发热，传播迅速，高发病率和低死亡率，是危害养猪业的重要疾病之一[1]。猪被认为是人和禽流感病毒互相传播的混合器[2-3]，对SIV流行情况的监测与研究对于公共卫生具有重要意义[4]。血清学调查证实，我国的猪群中一直存在H1和H3亚型SIV的流行[5-6]，不同地区和不同时间流行的病毒亚型有所差异。2009年初在墨西哥爆发的H1N1流感病毒感染，其病原就是一个具有猪源病毒基因的H1N1亚型流感病毒，它主要感染儿童和青年，致病性比人类季节性流感稍强，传播能力强，在极短时间内传播到多个国家[7-9]。这提示我们加强猪流感的监测是非常必要，我国对于SIV的研究还处于发展阶段，主要工作是开展SIV的血清学和病原流行病学调查[10-12]，其相应的快速监测方法及相关诊断手段正在逐步建立和完善之中。

对于SIV感染的监测与诊断，一个合理、方便、快捷的诊断方法就显得非常必要和紧迫。目前为止，经典的流感病毒的病原学以及亚型鉴定方法由于使用的多克隆抗体具有一定的亚型间交叉反应，而单克隆抗体(MAb)因其优良的特异性，可以较好的解决病毒间的亚型特异性和交叉反应性的问题。基于此本实验室开展了针对H1N1亚型流感病毒特异性MAb的研究，并获得具有良好亚型特异性的MAb细胞株，为该亚型病毒诊断以及抗原性差异性的相关研究提供了物质基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株 免疫及用于检测MAb的HI反应活性的H1亚型流感病毒分离株A/Swine/Guangdong/718/2001(H1N1)、 A/Swine/Jiangsu/662/2001(H1N1)、A/Swine/Guangdong/710/2001 (H1N1)、 A/Swine/Guangdong/729/2001 (H1N1)、 A/Swine/Guangdong/519/2001(H1N1)、H1亚型鸭源流感病毒参考株A/Duck/Alberta/35/76(H1N1)和H1亚型 SIV参考株A/Swine/Tennessee/26/77(H1N1)，以及用于 MAb特异性HI检测的H1～H15亚型流感病毒参考株均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点实验室保存。新城疫病毒(NDV)和减蛋综合症病毒(EDS)病毒抗原由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所相关研究室提供。H1亚型SIV抗原由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感实验室猪流感组制备。

1.2 细胞系与实验动物 小鼠SP2/0骨髓瘤细胞系及293T细胞系由本实验室保存，11日龄SPF鸡胚和6周龄～8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.3 质粒与主要试剂 真核表达质粒pCAGGS由本实验室保存，A/California/04/2009 A(H1N1)病毒株的HA基因序列(FJ966082)由南京金思特公司人工合成。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HAT选择培养基、HT培养基和PEG(MW1500)融合试剂均购自Sigma公司，胎牛血清、DMEM培养基、lipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，FITC标记羊抗鼠IgG购自Southernbiotech公司。

1.4 全病毒抗原制备 将A/Swine/Guangdong/718/01种毒经11日龄SPF鸡胚尿囊腔接种扩增，72 h收集感染鸡胚的尿囊液，27 000 r/min超速离心2 h浓缩病毒，26 500 r/min蔗糖密度梯度离心(20%、40%、60%)2 h纯化病毒。

1.5 MAb的制备

1.5.1 动物免疫 稀释纯化病毒至200 μg/mL，2‰甲醛灭活后与弗氏完全佐剂等体积乳化混匀，腹腔和皮下分别注射雌性8周龄BALB/c小鼠，0.2 mL/只。以后每间隔两周用等量弗氏不完全佐剂乳化，加强免疫2次，剂量同首免。融合前3 d加强免疫，剂量加倍。

1.5.2 血凝抑制检测方法的建立 小鼠血清在HI实验前采用胰酶-高碘酸钾方法进行处理，其余部分同常规HI方法。

1.5.3 细胞融合和阳性杂交瘤细胞的筛选 按参考文献[14]的方法，将免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合后，在第3 d、7 d时分别用HAT选择培养基半换液，10 d后改用HT培养基培养，待细胞集落长到1/2培养孔大小时用血凝抑制实验进行检测、筛选。

1.5.4 阳性细胞株的克隆纯化 取阳性克隆孔内的杂交瘤细胞，用完全培养液稀释至终浓度为8个～9个细胞/mL，每个培养孔加已稀释的细胞悬液100 μL。待细胞集落长到1/2培养孔时，再次检测，挑选单克隆阳性孔细胞进行下一轮筛选纯化，直至所有克隆化细胞生长孔为HI阳性，获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

1.5.5 腹水的制备 选6周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5 mL/只，7 d～10 d后腹腔注射5×105个杂交瘤细胞，待小鼠腹部膨大后收集腹水，腹水4℃静置过夜。次日3 000 r/min离心10 min收集上清，分装保存于-70℃备用。

1.6 MAb的生物学特性鉴定

1.6.1 抗体效价的测定 以A/Swine/Guangdong/718/01病毒株配制4个单位血凝价的病毒(u)，采用HI方法测定MAb腹水及细胞培养上清效价。

1.6.2 抗体亚类的鉴定 采用SBA ClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒测定，方法按试剂盒说明进行。

1.6.3 抗体特异性的鉴定 将MAb腹水分别与流感病毒H1～H15亚型参考毒株及其他具有血凝活性的禽类病毒株(NDV、EDS)进行血凝抑制交叉试验。血凝抑制阳性判为有交叉反应，血凝抑制阴性判为无交叉反应。

1.6.4 抗体与H1亚型的不同毒株交叉实验 选择6株以前分离到的H1亚型流感病毒株，分别配制8单位抗原，利用A6F、2BBF和2BB MAb腹水分别对其进行血凝抑制实验，检测它们与6株H1亚型不同流感病毒株的抗原交叉反应性。

1.6.5 针对现在流行的H1亚型SIV株的HI反应将制备的杂交瘤细胞进行细胞复苏培养,适时收集培养上清，并以雌性BALB/c小鼠制备腹水。利用得到的细胞株培养上清及腹水对来自于猪流感室的H1亚型SIV抗原进行HI试验。

1.6.6 抗体叠加试验 将H1亚型SIV抗原以1∶160倍稀释，100 μL/孔包被ELISA板，将杂交瘤腹水以10倍倍比稀释，测定其饱和浓度。将MAb按饱和浓度分别两两配对，计算叠加后的增值指数。

1.6.7 与甲型H1N1流感病毒HA抗原的IFA检测构建A/California/04/2009A(H1N1)毒株的HA基因真核表达重组质粒ph1-PCAGGS，转染293T细胞，48 h后用预冷的甲醇丙酮(v∶v=1∶1)固定。用 H1亚型杂交瘤细胞培养上清及sp2/0培养上清进行IFA检测，评价已制备的各个MAb与目前流行H1N1毒株抗原的交叉反应性。

2 结果与讨论

2.1 MAb的筛选与杂交瘤细胞株的建立 经过细胞融合、HI方法筛选及有限稀释法克隆，共获得11株能高效分泌具有血凝抑制活性的特异性MAb的杂交瘤细胞株，分别命名为5CC、A6F、1FE、2EE、 2BB、 8HB、 3DE、 2FG、 2BBF、 7FC 和1DH。

2.2 MAb的效价测定 HI方法测定11株MAb的腹水HI效价，结果显示11株MAb HI效价11 log2～22 log2。

2.3 抗体亚类鉴定 利用SBAClonotypingTMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒对11株MAb亚类鉴定的结果显示：11株MAb中1FE、A6F和1DH为IgG2a亚型，8HB为IgG2b亚型， 2BBF、2BB和 3DE为 IgG3亚型，5CC、2EE、7FC和 2FG为IgG M亚型，轻链均为κ链。

2.4 MAb的特异性实验 HI方法检测结果显示，11株MAb完全不与NDV和EDS病毒发生反应，也不与其他亚型流感病毒发生血凝抑制反应，表明11株MAb均能特异性识别H1亚型流感病毒的血凝素蛋白，具有良好的病毒特异性和亚型特异性。

2.5 MAb与亚型内不同毒株的交叉反应性 取其中3株MAb A6F、2BBF和2BB对我国不同地区分离株及猪源、禽源H1N1参考株进行交叉抗原性分析，结果显示：3株MAb与江苏分离株A/Swine/Jiangsu/662/01(H1N1)及鸭源参考株A/Duck/Alberta/35/76(H1N1)等反应性非常好，而与广东的两个分离株 A/Swine/Guangdong/710/01(H1N1)、A/Swine/Guangdong/729/01(H1N1)及猪源参考株A/Swine/Tennessee/26/77(H1N1)反应性较差(表 1)，从而也可以看出我国不同地区分离株的抗原性差异较大，与我们制备的MAb反应性表现出较大的差异，表明这3株MAb可为相关病毒株抗原性差异的研究提供新的思路和手段。

2.6 11株MAb对SIV H1亚型抗原的反应性 利用这11株MAb对SIV H1亚型抗原进行HI试验，结果表明A6F、8HB、2FG和2BBF对SIV H1抗原的HI效价较低(表2)。这表明现在流行的H1亚型SIV毒株可能与A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)的抗原性不同，也间接表明我国不同时期流行的H1病毒株抗原性变异的渐进性。

表1 H1 MAb与不同毒株的HI试验结果Table 1 The HI titration of MAbs against different H1 influenza virus strains

表2 11株MAb对SIV H1亚型标准抗原的反应性Table 2 The HI titieration of MAbs to the H1 subtype swine influenza virus

2.7 MAb叠加试验 测定SIV H1亚型抗原的最佳包被浓度，根据测定结果以1∶160倍稀释抗原，100 μL/孔包被ELISA反应板。测定11株MAb腹水的饱和浓度，以1∶100稀释腹水进行MAb叠加试验。计算各配对的增值指数(AI)，大于10%的配对MAb有：1FE 和 8HB(AI为 14%)、1FE 和 2BBF(AI为 17%)、8HB和3DE(AI为 44%)、8HB 和 1DH(AI为 49%)、3DE 和 7FC(AI为 47%)、1DH 和 7FC(AI为 42%)，结果表明，这些配对MAb可能识别不同的抗原决定簇，可进一步被用来建立针对H1亚型SIV的双抗体夹心ELISA方法及免疫金标记检测方法，为我国目前猪流感的监测提供快速准确的新方法。

2.8 针对A/California/04/2009A(H1N1)株HA抗原的IFA检测 将A/California/04/2009A(H1N1)的HA基因序列插入到pCAGGS质粒上构建真核表达质粒pCAGGS-H1，转化扩增得到重组质粒后进行酶切鉴定，经鉴定正确后转染293T细胞，同时以pCAGGS质粒转染293T细胞做为阴性对照，以11株杂交瘤细胞及SP2/0骨髓瘤细胞的培养上清对转染后293T细胞分别进行 IFA试验,结果表明 2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB可以特异性识别293T细胞内表达的HA抗原，空载体转染组及SP2/0阴性对照则不反应(图1)，从而证实这些MAb可以识别今年爆发的甲型H1N1流感株(A/California/04/2009A)，可用来针对目前流行H1N1毒株开展诊断工作，为其快速诊断方法的建立提供物质基础。

为更好开展猪H1N1亚型流感的研究，提高猪流感诊断方法的特异性和敏感性，我们研制了一系列的H1亚型特异性MAb，以期能够对当前流行的H1亚型流感病毒进行特异性快速诊断。本研究制备MAb与不同H1亚型流感病毒株的HI反应结果表明，我国不同地区不同时期病毒分离株的抗原性存在一定的差异，不同MAb针对不同毒株的反应性有所不同，表明H1病毒在流行进化过程中其相关抗原位点发生一定改变，从而导致疫苗使用效果不佳，是当前流感疫苗预防和防疫中应该高度重视的问题。MAb识别谱的差异性不仅仅在H1亚型内发生，其他亚型流感病毒，如H5和H9亚型病毒也普遍存在这种现象，流感病毒抗原性漂变是流感病毒变异的一个重要特性。本研究研制的具有HI活性的H1亚型SIV特异性MAb，尽管对于不同分离株血凝抑制作用有一定差异，但是大部分MAb可以良好识别国内目前H1亚型SIV流行株，部分MAb也可以识别目前大流行的H1病毒株，这些特异性MAb的制备可以为H1亚型流感监测提供有力工具，为新型H1亚型流感病毒的快速诊断试剂的研制提供了物质保障。由于不同来源的猪、禽流感病毒或人源流感病毒都可以感染猪，并在猪体内重组，产生新的重组病毒，其特性有可能发生改变，从而导致新型流感病毒传染人或在猪群内流行。因此，加强国内H1亚型SIV流行毒株监测不仅对于我国动物养殖是十分必要的，而且对于公共卫生也具有重要意义。2009年爆发的新型H1N1流感就是一个典型的病毒重组变异的结果。目前，甲型H1N1流感已经席卷全球，给人类健康威胁，各国对甲型H1N1流感的防控已经提高到前所未有的高度。

本研究制备的具有血凝抑制活性的H1亚型流感病毒特异性的MAb，具有良好的流感病毒亚型特异性，而且可以识别当前流行的甲流毒株的HA抗原，为H1亚型流感病毒的快速鉴别诊断和相关抗原性基础研究奠定了一定的物质基础，对甲型流感疫情的防控也有较强的现实意义。

[1]Vincent A L,Ma W,Lager K M,et al.Swine influenza viruses a North American perspective[J].Adv Virus Res.2008,72:127-54.

[2]于康震，陈化兰，唐秀英.97'香港禽流感[J].中国预防兽医学报，1998，20(3)：178-191.

[3]Nerome K,Kanegae Y,Shortridge K F,et al.Genetic analysis of porcine H3N2 viruses originating in southern China[J].J Gen Virol.1995,76:613-24.

[4]Shortridge K F.Pandemic influenza:a zoonosis?[J]Semin Respir Infect.1992,7(1):11-25.

[5]李海燕，李雁冰，于康震，等.猪流感病毒的分离鉴定[J]，中国预防兽医学报，2002，24(1)：12-17.

[6]李海燕，辛晓光，于康震，等.H3N2亚型猪流感病毒中国分离住的克隆及生物学特性[J].中国预防兽医学报，2003，25(6)：560-563.

[7]Garten R J,Davis C T,Russell C A,et al.Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza viruses circulating in humans[J].Science 2009,325:197-201.

[8]Smith G J D,Vijaykrishna D,BahlJ,et al.Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic[J].Nature,2009.

[9]Peiris M,Leo J S,Poona L M,et al.Emergence of a novel swine-origin influenza A virus(S-OIV)H1N1 virus in humans[J].J Clin Virol,2009,45(3):169-73.

[10]王连想，毕英佐，曹永长.6株猪流感病毒肥猪HA部分基因的克隆和序列分析[J].中国兽医学报，2003，23(5)：438-441.

[11]许传田，范伟兴，赵宏坤.A型猪流感病毒山东分离株鉴定及其 HA基因序列分析[J].中国病毒学，2004，19(1)：27-31.

[12]李海燕，于康震，辛晓光，等.部分省市猪流感的血清学调查及猪流感病毒的分离鉴定[J].动物医学进展，2003，24(3)：67-72.

[13]王海丽，徐公义，王长军，等.猪链球菌2型人源分离株EF单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国预防兽医学报，2008，30(7)：562-565.

[14]张立春，邓国华，刘振勇，等.具有HI活性的抗H5亚型流感病毒特异性单克隆抗体的研制[J].中国预防兽医学报，2005，27(5)：329-332.