基于线粒体nad4基因探讨土耳其斯坦东毕吸虫的系统发生位置

王 宇，肖景莹，王春仁*，高俊峰，朱兴全

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯， 154007；3.华南农业大学兽医学院，广东广州， 510642）

基于线粒体nad4基因探讨土耳其斯坦东毕吸虫的系统发生位置

王 宇1，肖景莹2，王春仁1*，高俊峰1，朱兴全3

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯， 154007；3.华南农业大学兽医学院，广东广州， 510642）

为探讨土耳其斯坦东毕吸虫在血吸虫中的系统发生位置，本研究设计一对特异性引物，通过PCR方法对土耳其斯坦东毕吸虫(绵羊源）线粒体烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因(nad4）进行扩增和测序分析，并与GenBank中相关血吸虫nad4基因进行比对。结果显示，本研究克隆的该吸虫线粒体nad4基因序列大小约为1 030 bp，与已发表的其它血吸虫线粒体nad4基因的同源性为51.6%～66.7%，其系统发生位置属于非洲血吸虫种群。

土耳其斯坦东毕吸虫；线粒体DNA；烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因；系统发生

土耳其斯坦东毕吸虫(Orientobilharzia turkestanicum）是寄生于牛、羊等多种动物门静脉和肠系膜静脉的一种血吸虫，引起动物的东毕吸虫病，该虫的尾蚴还可感染人，引起人的尾蚴性皮炎[1]。土耳其斯坦东毕吸虫病主要分布于亚洲和欧洲的一些地区，常呈地方性流行，对畜牧业危害严重，该病为黑龙江省重要的吸虫病之一[2]。

关于O.turkestanicum的分类地位，我们曾先后利用线粒体cox1和nad1基因和核糖体ITS和28SrDNA-LSU序列进行了一些研究工作，并推断O.turkestanicum隶属于非洲血吸虫种群[3-4]。然而，在遗传标记基因中，线粒体DNA(mtDNA）中的烟酰胺脱氢酶亚基Ⅳ基因(nad4）是一个进化率较高的基因，利用它作遗传标记对寄生虫进行群体遗传和分类研究具有重要意义[5-7]。因此本研究以nad4基因作为标记基因，进一步探讨O.turkestanicum在系统中的分类地位。

1 材料和方法

1.1 虫体样品 通过粪便检查，选择黑龙江省大庆市自然感染东毕吸虫的绵羊，剖检收集虫体，经形态学鉴定为O.turkestanicum，虫体保存于70%乙醇中备用。

1.2 实验材料 EasyPure Genomic DNA Extraction Kit和EasyPure Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司；StarPrep Gel Extraction Kit购自北京康润诚业生物科技有限公司；pGEM-T购自Promega公司；LATaqDNA聚合酶、EcoRⅠ限制性内切酶和XhoⅠ限制性内切酶DNA Marker(DL2000、DL15000）购自宝生物工程(大连）有限公司；大肠杆菌(E.coli）感受态细胞TG1由本实验室制备保存。

1.3 虫体总DNA的提取 将15条土耳其斯坦东毕吸虫成虫置于无菌的1.5 mL离心管中，用北京全式金生物技术有限公司DNA抽提试剂盒提取虫体总DNA，提取的DNA样品置于-20℃保存备用。

1.4nad4基因的扩增与纯化 根据GenBank登录的梭形血吸虫(NC_008067）和埃及血吸虫(NC_008074）nad4基因保守区，设计一对用于扩增线粒体nad4基因的特异性引物，上游引物为5'-ATGTAT TCGAGTTCCGTTTGG-3'；下游引物为5'-AAAAAC TGAAGAGTTGGTGGAAACC-3'。PCR反应体系为25 μL；反应条件为：94℃10 min；94℃30 s、49℃30 s、72℃1.5 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测后，进行纯化。

1.5nad4基因的克隆 将纯化nad4基因PCR产物与pGEM-T连接，转化E.coliTG1感受态细胞，提取质粒DNA，然后进行PCR和双酶切鉴定。

1.6nad4基因的测定与分析 经过鉴定为阳性的nad4重组质粒由北京英骏生物技术公司进行测序，利用DNAStar和ClustalX1.83软件对nad4基因序列进行比对，分析O.turkestanicum线粒体nad4基因与其他血吸虫的nad4基因的同源性，利用MEGA3.1软件，以肝片形吸虫(Fasciola hepatica）为外群，采用邻接法构建系统发生树，探讨O.turkestanicum在血吸虫分类中的地位。

2 结果和讨论

2.1nad4基因的扩增 应用特异性引物从分离的O.turkestanicum线粒体基因组DNA扩增出约为1 000 bp的nad4基因片段，与预期目的片段长度相符(图1）。将PCR纯化产物与pGEM-T载体连接后转化E.coliTG1感受肽细胞，提取重组质粒DNA进行双酶切鉴定。双酶切鉴定结果表明，nad4基因成功克隆至pGEM-T载体的多克隆位点中。

2.2nad4基因的序列分析 经DNAStar 6.0软件分析，O.turkestanicum线粒体nad4基因的同源性和遗传距离如表1所示。通过同源性比较及进化关系表明，O.turkestanicum与其它血吸虫线粒体nad4基因的同源性为51.6%～66.7%，与梭形血吸虫最为相近，同源性达到66.7%。

将O.turkestanicum的nad4基因与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、梭形血吸虫、湄公血吸虫、日本血吸虫等10种血吸虫比较，其同源性在51.6%～66.7%之间，其中与梭形血吸虫的同源性最高，可见，O.turkestanicum与梭形血吸虫的亲缘最近。

以肝片形吸虫nad4基因作为该进化树的外群，采用NJ法构建O.turkestanicum进化树(图2）。由血吸虫nad4基因构建的进化树可以看出，血吸虫被分为两个群：裂体属的血吸虫和其它属的血吸虫，其中O.turkestanicum的发生位置处于裂体属血吸虫中，裂体属血吸虫又被分为两个群：非洲血吸虫种群和亚洲血吸虫种群，其中O.turkestanicum的发生位置处于非洲血吸虫种群中。

与GenBank登录的其他吸虫的nad4基因的序列进行比对，我们得出结论，马来血吸虫、日本血吸虫和湄公血吸虫均属于亚洲血吸虫种群，而O.turkestanicum与埃及血吸虫、曼氏血吸虫、梭形血吸虫以及罗海因血吸虫均属于非洲血吸虫种群。这一结论与Li等和Wang等在对cox1、nad1、ITS1以及ITS2等基因的分析中所得出的结论一致[3-4]。

mtDNA为双链闭环分子，具有独立进化且速率比核DNA快、基因组精简等特点[8]，同时由于线粒体为母系遗传，线粒体基因间不发生重组，所以可以反映出母系的进化历史，这样线粒体一个基因就可以代表整个线粒体基因组的变异情况。线粒体基因在血吸虫分类地位和种系发生的研究十分可靠，尤其是适合于较近缘的物种之间的研究，但应用较多的标记基因主要为cox1，应用nad4的较少。Blouin等通过对毛圆科(Trichostrongylidae）中的4个种的nad4序列进行种间和种内比较，分析得出nad4无论在种间还是在种内都具有高度的变异性和多态性[9]。通过对O.turkestanicum的nad4序列分析，发现其种间序列差异(32.3%～48.4%）大于cox1基因种间序列差异(20.4%～22.2%），表明线粒体nad4基因进化较快，比cox1基因更加适合用于寄生虫分类地位的研究，这与Blouin等分析20种线虫的cox1和nad4序列结果一致[10]。本研究结果表明，O.turkestanicum属于非洲血吸虫种群，这为进一步研究血吸虫的起源提供了参考。

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Molecular phylogeny ofOrientobilharzia turkestanicumbased on nucleotide sequences of mitochondrialnad4gene

WANG Yu1,XIAO Jing-yin2,WANG Chun-ren1*,GAO Jun-feng1,ZHU Xing-quan3
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China;2.College of Basic Medicine,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;3.College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China）

To determine the molecular phylogeny ofOrientobilharzia turkestanicumbased on nucleotide sequences of mitochondrialnad4gene encoding NADH dehydrogenase subunit 4,thenad4gene was amplified by PCR using the specific primers,sequenced and compared with related schistosomes in GenBank.The results showed that the nad4 sequence was 1 030 bp in length and shared 51.6%to 66.7%homology amongO.turkestanicumandschistosomaspecies.The phylogenetic tree revealed thatO.turkestanicumbelonged to african schistosome group.

Orientobilharzia turkestanicum;mitochondrial DNA;nad4;molecular phylogeny

S852.735

A

1008-0589(2010）03-0218-03

*Correspondingauthor

2009-08-23

广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室开放项目；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.11511253）

王 宇(1984-），女，黑龙江哈尔滨人，研究方向为兽医寄生虫学与寄生虫病学.

*通信作者：E-mail：chunrenwang@yahoo.com.cn

(本文编辑：陈立群）