靶向新城疫病毒NP基因的shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定

杨 帆，岳 华，侯 巍，汤 承

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041)

RNA干涉(RNAi)是指双链RNA(dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解,使相应基因沉默。研究发现，其基本作用方式是通过Dicer酶将dsRNA切割成2l nt～23 nt的小干扰RNA(siRNA)，siRNA与一种核蛋白体结合，形成RNA诱导的沉默复合体(RISC)，在ATP的参与下，siRNA解链，并引导RISC与其序列同源的mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，将靶mRNA切断，从而阻断基因表达[1]。大量的研究报告显示RNAi已经成为研究基因组功能的主要手段，并广泛地应用于抗病毒治疗的研究。如Huh-7细胞内表达的发夹样结构小干扰RNA(shRNA)能抑制乙型肝炎病毒的增殖[2]；慢病毒载体表达的shRNA能使HIV感染细胞的病毒基因表达量降低90%以上，抗病毒效应可持续35 d以上，能抵抗连续4次病毒的攻击[3]。siRNA的转染效率直接影响着干涉效果，脂质体等转染试剂对原代细胞转染效率低，是在其中进行RNAi研究的主要障碍。腺病毒载体以其高容量、感染细胞类型多、不会重组到宿主细胞的染色体组中、能够长时间表达外源基因的优点被广泛应用于哺乳动物RNAi的研究[4]。本实验室研究证明，表达靶向NDV NP基因的shRNA重组质粒能有效抑制NDV的增殖[5]，为进一步探讨shRNA在活体中应用的可能性，本研究通过同源重组构建了表达siRNA分子的重组腺病毒，在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚上评价了对鸡新城疫病毒(NDV)增殖的干涉效果。

1 材料和方法

1.1 病毒株、载体和细胞 NDV F48E9株，购自中国兽药监察所；携带红荧光蛋白(RFP)报告基因的shRNA重组质粒(pGenesil-3)由本实验室构建，siRNA序列为AGGATGCCAACAAACCACT；腺病毒表达载体(pGSadeno)购自武汉晶赛公司；HEK 293细胞由南京农业大学姜平教授惠赠；感受态细胞DH5α购自TaKaRa公司；鸡SPF种蛋购自南京药械厂。

1.2 主要试剂 T4 DNA Ligase、PI-SceI、I-CeuI、PacI内切酶购自NEB公司；重组试剂购自Invitrogen公司；METAFECTENETM转染试剂购自Biontex公司；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；DMEM高糖培养基购自Gibco公司。

1.3 shRNA质粒与pGSadeno载体重组 按照重组试剂说明书的方法将含有shRNA的pGenesil-3质粒与pGSadeno载体重组，重组产物转化感受态细胞DH5α，挑取单菌落培养，提取重组质粒。用PISceI/I-CeuI双酶切鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 重组腺病毒的包装及效价测定 用PacⅠ酶切重组质粒制备线性化的DNA，依照METAFECTE NETM推荐程序，转染HEK293细胞，24 h后观察RFP报告基因的表达及细胞病变(CPE)。当细胞出现特异的红荧光以及明显的CPE，而且有超过50%细胞脱落时收取培养物，即为重组腺病毒(adv-RFP)。将Ade-RFP用DMEM 10倍递增稀释(10-1～10-7)，每个稀释度取400 μL接种HEK293细胞单层的24孔板，每剂量设3孔重复。空白对照孔加入400 μL含10%小牛血清的DMEM， 37℃ 5%CO2培养24 h，在荧光显微镜下对RFP阳性细胞进行计数。按照下列公式计算病毒效价，病毒效价(pfu/mL)=RFP阳性细胞数×稀释倍数/接种病毒的体积(mL)。

1.5 重组腺病毒的鉴定 用100 MOI adv-RFP感染CEF，4 h后接种100 TCID50的NDV作为干涉组，以等量pGSadeno空载体替代adv-RFP按上述方法处理CEF做为阴性对照，每组设3孔重复。NDV感染后6 h、9 h、12 h收取干涉组及阴性对照组的细胞和培养液，按照TRIzol试剂说明书提供的方法提取RNA，反转录为cDNA。参照文献[5]方法检测NDV NP基因mRNA的表达水平。以RPL4为内参基因，使用本实验室建立的鸡RPL4荧光定量检测方法，引物为P1:5'-TTATGCCATCTGTTCTGCC-3'；P2：5'-GCGATTCCTCATCTTACCCT-3'，反应体系 20 μL：SYBR Green I 10 μL、 ROX 0.4 μL、 P10.5 μL、P20.5 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.6 μL。反应条件：95 ℃5 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环。用2-△△Ct方法对NDV NP基因进行相对定量[6]。

1.6 Ade-RFP对NDV增殖的影响 首先用50、100、150 MOI adv-RFP感染CEF，4 h后弃培养液，接种100 TCID50/孔的NDV，吸附30 min后加200 μL/孔的含5%小牛血清的DMEM维持液，将其作为干涉组，以等量pGSadeno空载体替代adv-RFP按上述方法处理CEF做为阴性对照，均设立3孔重复。37℃5%CO2培养。于Ade-RFP感染12 h、18 h、24 h、30 h、36 h观察细胞的形态，并测定培养液中NDV的血凝价。选取13日龄SPF鸡胚，通过静脉注射接种0.2 mL Ade-RFP，同时绒毛尿囊腔接种NDV 0.2 mL，共接种9枚。按照同样方法以pGSadeno替代Ade-RFP接种9枚做对照，置于孵化器培养，于接种后24 h、36 h、48 h观察鸡胚的活力，并取尿囊液测定NDV的血凝价。

2 结果

2.1 PI-SceI/I-CeuI双酶切鉴定 重组腺病毒质粒经PI-SceI/I-CeuI双酶切后电泳出现1条约3 kb的目的条带和1条大于15 kb的腺病毒载体条带。

2.2 Ade-RFP效价测定 Ade-RFP感染HEK293细胞24 h后，10-5稀释度3个重复孔的荧光细胞数平均为61个/孔，按照2.1.2中公式计算Ade-RFP的效价为3.05×107pfu/mL。

2.3 Ade-RFP感染CEF adv-RFP感染CEF 24 h后可通过倒置荧光显微镜观察到红荧光报告基因的表达，pGSadeno空载体对照组未出现特异的红荧光(图1)。说明adv-RFP能够感染CEF，并且可将特异的shRNA递送进CEF中。

2.4 Ade-RFP对NDV NP基因mRNA的表达效率检测 荧光定量PCR检测NP、RPL4基因的溶解曲线和扩增曲线如图2。Ade-RFP在6 h、9 h、12 h显著抑制了NDV NP基因mRNA的表达，与对照组中NP基因mRNA的水平相比，分别下降了3.2倍，25.6倍，2.57倍(图3)。

2.5 adv-RFP对CPE的抑制作用 100 MOI adv-RFP能够延缓CEF中CPE的出现，干涉组在NDV感染18 h后细胞形态规则，生长良好。对照组18 h时细胞圆缩并出现脱落，导致大小不等空斑的出现，贴壁细胞出现大小不一、形态各异的合胞体。24 h后干涉组少量细胞死亡，对照组细胞完全崩解。

2.6 Ade-RFP抑制NDV在CEF中的增殖 50 MOI adv-RFP对NDV的增殖影响不显著，随着adv-RFP用量的增加对NDV增殖抑制的作用逐渐增强。不同剂量的adv-RFP组在 12 h、18 h、24 h、30 h、36 h测得细胞培养液中NDV的血凝价见表1，从试验结果可见，干涉组NDV的血凝价均比对照组低，而且差异显著(p＜0.05)。

表1 adv-RFP在CEF上对NDV增殖的影响(血凝单位)Table 1 Inhibition of NDV replication in CEF by adv-RFP

2.7 Ade-RFP抑制了NDV在鸡胚中的增殖 鸡胚接种病毒后对照组于36 h死亡，干涉组鸡胚的死亡时间比对照组晚12 h。36 h之内adv-RFP对NDV在鸡胚上的增殖具有抑制作用，24 h、36 h测得干涉组NDV的血凝单位均比对照组低，而且差异显著(p＜0.05)，结果见表2。

表2 adv-RFP在鸡胚上对NDV增殖的影响(血凝单位)Table 2 Inhibition of NDV replication in chicken embryo by adv-RFP(HA)

3 讨论

研究表明，RNAi在抗病毒治疗上已展现了巨大的潜力。RNAi已被证明能高效抑制病毒的复制，如应用RNAi在小鼠体内抑制乙型肝炎的复制[7]；在人细胞系中抑制艾滋病病毒的复制[8]；抑制流感病毒的复制[9]；本实验室构建的靶向NDV NP基因的shRNA质粒表达载体可以在CEF上显著抑制NDV的增殖[10]。腺病毒载体已经广泛地应用于RNAi研究，如应用腺病毒载体介导的RNA干扰抑制口蹄疫病毒的复制研究[11]；腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达[12]。在CEF中应用腺病毒载体表达shRNA的RNA干涉研究未见报道。本实验利用已经构建的靶向NDV NP基因的shRNA质粒通过同源重组构建了表达靶向NDV NP基因shRNA的腺病毒，adv-RFP感染CEF 24 h后可在荧光显微镜下观察到报告基因的表达，表明shRNA已被递送到CEF中，而且荧光定量PCR检测NDV NP基因显示adv-RFP可显著降低NP基因mRNA的表达，证明载体构建成功。

adv-RFP可推迟NDV感染CEF后CPE的出现；并且显著降低了NDV NP基因mRNA的表达，从而抑制了NDV在CEF中的复制。血凝价检测结果显示干涉组血凝价低于阴性对照组，而且差异显著(p ＜0.05)。

adv-RFP在CEF和鸡胚中均可抑制NDV的增殖，与对照组比较能够推迟鸡胚死亡时间约12 h，为进一步在鸡体中进行RNAi研究奠定了基础。

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