犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

高晓宇，曹荣峰，张桂红*，李守军*

(1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109)

犬流感是由犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)引起犬以体温升高、咳嗽、流鼻液、食欲减退、呼吸困难为主要特征的疾病。2004年，在佛罗里达首次从犬体内分离到流感病毒，该病毒是由甲型H3N8流感病毒引起，而且其遗传性和抗原性与当时的H3N8马流感病毒非常相似[1]。2007年，在韩国出现了犬流感H3N2病毒，该病毒源于禽类，而且犬之间通过接触可以传播[2]。近几年，本实验室在我国华南地区也分离到了CIV。鉴于CIV可以跨种和种内传播，以及危害犬类的健康，因此，建立CIV快速检测技术，将对犬流感的监测与防控发挥重要作用。

目前，实验室确诊CIV常用2种方法，病毒分离鉴定和RT-PCR检测方法。这2种方法费时费力且需要一定的实验室条件。Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(Loopmediated isothermal amplification， LAMP)[3]。 该方法具有特异性强、灵敏度高、扩增高效、快速、步骤简单、鉴定简便等优点。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法[4-7]，在耐药性基因检测[8]、家畜早期胚胎性别判定[9]等方面也有相关报道。本研究依据CIV的膜蛋白(M)基因序列保守区域设计了LAMP引物，建立了一种CIV的RT-LAMP早期快速检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株 CIVA/canin e/guangzhou/01/2006(H3 N2)株(CGZ1株)、试验所用犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)和犬副流感病毒(CPIV)等均由华南农业大学兽医学院临床兽医系外科教研室分离保存。

1.2 试 剂 TRIzol LS Reagent为Invitrogen公司产品；AMV反转录酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker、One Step RNA PCR试剂盒均为宝生物工程(大连)有限公司产品；甜菜碱(Betaine)为Sigma公司产品；Bst DNA聚合酶大片段为北京纽英伦生物技术有限公司产品；荧光染料SYBR GREENⅠ为杰特伟公司产品。

1.3 引物的设计与合成 参照CIV膜蛋白(M)基因序列，应用DNAStar软件MegAlign程序进行分析，利用PrimerExplorer V4软件在序列保守区域设计LAMP 引物(表 1)。

表1 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the primers

1.4 病毒RNA的抽提 参照TRIzol LS Reagent使用说明书进行病毒RNA的抽提。

1.5 RT-LAMP方法的优化及建立 根据反应体系优化策略，对 MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、引物浓度等分别进行了优化。

根据引物Tm值，将温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增，确定最佳退火温度。反应时间按30 min、45 min、60 min、90 min、120 min优化，确定最佳反应时间。

1.6 RT-LAMP方法的灵敏性 将抽提所得的CIV总RNA 10倍稀释至10-6，并使用紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度分别为100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、0.1 pg、0.01 pg。对上述各浓度RNA用RT-LAMP和RT-PCR方法同时进行检测。一步法RT-PCR按照One Step RNA PCR试剂盒操作说明书进行。

1.7 RT-LAMP方法的特异性 分别以CDV、CPV和CPIV作为样品，同时设立阴性对照，采用上面优化的反应体系和反应条件，检测所建立RT-LAMP方法的特异性。

1.8 RT-LAMP反应产物的分析 RT-LAMP反应最终产生白色混浊焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼或实时浊度计进行结果观察，而添加1 μL SYBR Green I DNA荧光染料(橙色)可进行可视化观察，在室温放置5 min，紫外光下观察，阳性产物呈现绿色荧光。使用琼脂糖凝胶电泳技术对产物进行分析，阳性反应呈现弥散型条带。

1.9 临床样品的检测 通过病毒分离、血凝(HA)和血凝抑制(HI)实验检测为CIV阳性的44份人工感染犬流感病毒的组织样品，用RT-LAMP和常规RT-PCR 2种检测方法，对比其符合率。

2 结果

2.1 环状引物对LAMP反应的影响 环状引物LoopF、LoopB结合于LAMP反应生成的哑铃状产物的环状部位，同时启动DNA链置换反应，生成一系列核酸结构，上述产物可以进一步用于LAMP反应，从而加速LAMP反应速度[12]。本研究使用定点凝胶电泳检测的(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)方法加入或不加入环状引物LoopF、LoopB的LAMP反应进行实时检测。结果表明：在LAMP反应中使用环状引物可以有效的提高反应速度和效率。

2.2 优化的反应体系和反应条件 对反应体系和反应条件分别进行调整，优化的反应体系见表2。反应条件为63℃45 min，80℃2 min结束。

表2 CIV RT-LAMP的最佳反应体系Table 2 Optimized reaction system for CIV RT-LAMP

2.3 RT-LAMP检测结果 按照优化的反应体系和反应条件对试验样品进行RT-LAMP检测，结果出现典型的LAMP条带(图1)，初步表明该方法可用于CIV的检测。

2.4 RT-LAMP实验结果的判定 RT-LAMP反应体系中，生成的磷酸盐可与镁离子结合生成白色的副产物-焦磷酸镁，通过比较其浊度可对结果进行判定，阳性反应有白色沉淀，透明则为阴性。同时RT-LAMP反应体系存在扩增产物，反应结束后加入SYBR Green I(橙色)，紫外灯下肉眼即可观察到强烈的绿色荧光；空白对照或其它毒株DNA则不发生颜色变化(图2)。

2.5 RT-LAMP敏感性检测结果 图3的第6泳道有稍浅的条带出现，在用SYBR GREENⅠ进行荧光染色后也有荧光出现，表明所建立的RT-LAMP方法的最小检测限为10-5即0.1 pg CIV RNA，即总RNA量约为0.1 pg。与RT-PCR方法相比，灵敏度更高(图 4)。

2.6 RT-LAMP特异性试验 分别以CIV阳性样品和CDV、CPV和CPIV样品，同时设立阴性对照作RT-LAMP特异性检测，结果以CIV阳性样品为模板的泳道出现明显的梯状条带，其它样品均呈阴性反应。结果表明引物对CIV具有特异性，可区分与犬流感病症相似的一些犬类传染病(图5)。

2.7 RT-LAMP临床试验 对CIV人工感染犬的组织样品，应用本研究建立的RT-LAMP方法和RTPCR方法检测，结果表明：对肺脏、心脏、肾脏组织，2种方法的阳性率检测均达到100%；对肝脏、脑，RT-LAMP方法的敏感性要明显高于RT-PCR方法。对44份临床阳性样品的检测，RT-LAMP和RT-PCR方法的检测结果的符合率为93.02%(表3)。

表3 应用RT-LAMP与RT-PCR检测人工感染CIV组织样品Table 3 Comparison of sensitivity between RT-LAMP and RT-PCR assays for 44 clinical samples obtained from CIV-infected

3 讨论

犬流感可在成犬之间的快速传播，引起犬的呼吸系统疾病，严重的会造成犬只死亡。对美国、韩国流行的犬流感病毒研究表明，这些流感病毒来源于异种动物。流感病毒可以突破种间屏障，感染异种动物。犬作为宠物与人接触密切，应对犬流感引起足够的重视。

建立一种行之有效的检测方法对于开展CIV的综合防治和疾病诊断具有十分重要的意义。目前已经建立病毒分离，血凝(HA)、血凝抑制(HI)检测方法以及RT-PCR方法。这些方法不仅实验条件要求高，而且耗时长，限制了其在基层兽医诊疗单位的使用。LAMP方法是一种简便、快速、准确、廉价的基因扩增法。本研究对CIV检测的反应条件，如引物设计、目的基因序列长度、环状结构大小及反应体系等方面进行了优化[10]，并在体系中加入反转录酶，建立了CIV RT-LAMP检测方法。研究结果表明所建立的CIV RT-LAMP检测方法具有较高的特异性、良好的灵敏度。该LAMP检测技术基本克服了目前在临床和实验室诊断CIV方面存在的一些不足，操作简便、可在等温条件下进行扩增、无需复杂仪器设备、成本低，为临床检测提供了一个快速简便的新方法，可以广泛用于犬流感病毒的早期诊断及预防控制方面。

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