牛型提纯结核菌素国家标准品的研制

关孚时，林朝洪，申咏红，肖朝云，李 翠，戴志红，张秀英，陆连寿，王在时

(1.中国兽医药品监察所，北京100081；2.中牧实业股份有限公司成都药械厂，四川成都610100)

1 材料和方法

1.1 实验材料 已标化的牛型PPD国家标准品(批号：2000，规格：3 mL/瓶)由本实验室制备，保存于中国兽医药品监察所；国际标准品(规格：58500 IU/1.8 mg)购自英国NIBSC；体质量约400 g白色健康豚鼠由中牧实业股份有限公司成都药械厂提供；2岁龄健康西门塔尔肉牛由四川省成都市双流县鑫山牧业公司牛场提供。

1.2 候选物的制备 制备待检牛PPD国家标准品样品4批[4]，每批约2000 mL(浓缩原液)，无菌检验合格后分装于500 mL瓶中，置2℃～8℃备用。

1.3 候选物的检定筛选 待检样品的检定包括纯度测定和氮含量测定，根据检定结果筛选适宜批次制备为待检国家标准品。

1.3.1 纯度测定 首先进行多糖含量测定[5]，采用蒽酮法，用日立UV-3010紫外分光光度计于620 nm波长处分别测定葡萄糖标准品和各个样品的OD值，根据标准葡萄糖浓度与对应OD值求回归公式，计算样品多糖含量；用紫外分光光度计于260nm波长处分别测定核酸标准品和各个样品的OD值[5]，根据标准核酸浓度与对应OD值求回归公式计算样品核酸含量。

1.3.2 氮含量测定 按文献[4]的方法，采用凯氏定氮法[6]，使用福斯凯氏定氮仪2300型对候选物进行氮含量测定，氮含量乘以6.25换算成蛋白质含量。

1.4 待检国家标准品的稀释、分装、冻干

1.4.1 稀 释 每支安瓿分装蛋白质含量1.8 mg，取待检国家标准品浓缩原液730 mL、pH7.4 PBS 470 mL、苯酚6 g混合均匀，得到待检国家标准品1200 mL。

同理，由典则反交换关系(2.5)可知， s=I-s也是L2(Γ,η)上的正交投影算子，且s与s相互正交。

1.4.2 分 装 用瑞士进口的Calibrex 520型数字式瓶端配液器(误差范围小于±1%)进行分装，每个安瓿分装量为1 mL，共分装待检国家标准品1178支(瓶内留有残余液体)。

1.4.3 冻 干 按照通常冻干曲线进行，保证物理性状和水分符合规定标准。冻干后的待检国家标准品保存在-30℃低温冰箱，供以下试验使用。

1.5 待检国家标准品的鉴定 待检国家标准品的鉴定包括物理性状检验、无菌检验、均匀性试验、效价测定、稳定性试验(耐老化试验)、特异性检验、安全性检验及协作标定(另文发表)。

1.5.1 物理性状检验 按照文献[4]方法进行。

1.5.2 无菌检验 按照文献[4]方法进行。

1.5.3 均质性试验 取稀释前的待检国家标准品浓缩原液样品3个，每个1.000 mL，分别进行氮含量测定。同时取冻干后的待检国家标准品15支，每支用1.000 mL生理盐水溶解，取0.500 mL在相同条件下测定氮含量，分别计算稀释前和冻干后变异系数。

1.5.4 效价测定 方法：参照文献[3]和文献[4]方法，将国际标准品和待检国家标准品分别稀释成蛋白质含量为 100 IU/mL、50 IU/mL、25 IU/mL和12.5 IU/mL，分别相当于蛋白质含量0.00308 mg/mL、0.00154 mg/mL、0.00077 mg/mL和 0.00038 mg/mL。挑选8只致敏豚鼠，采用轮回换点方式，在每只豚鼠拔毛处依次注射该8种菌素稀释液，每点皮内注射0.1 mL，24 h后，用游标卡尺测量皮肤红肿反应面积。计算4个稀释度国际标准品与待检国家标准品反应面积的差值平均值，并根据两者各自的4个稀释度反应面积平均值在同一个坐标系内作剂量反应曲线。

1.5.5 稳定性试验(耐老化试验) 方法：取待检国家标准品8支置50℃温箱内，每天记录温度，分别保存7 d、14 d、21 d和28 d。每个保存时间点取1支安瓿，用-30℃保存的待检国家标准品作对照，均稀释为0.00308 mg/mL(约100 IU/mL)，用5只豚鼠(要求和来源同效价测定)进行效价测定，分别计算效价下降程度平均值。

1.5.6 特异性检验 分别用健康易感牛和健康豚鼠进行特异性检验[3-4]。其中以牛进行的特异性检验用已标化的国家标准品做对照；以豚鼠进行的特异性检验用国际标准品做对照。

1.5.7 安全性检验 健康豚鼠2只，每只腹腔注射1 mg的待检国家标准品，观察其10 d内是否健活。

1.5.8 协作标定 拟安排有牛PPD检验经验的企业进行，由中国兽医药品监察所制定统一的协作标定方案，用国际标准品溯源标定，实验完成后统计数据，最后确定待检国家标准品国际单位含量。

2 结果

2.1 候选物的检定筛选 制备的4批牛PPD国家标准品候选物的多糖、核酸及蛋白质含量测定结果见表1。200804批候选物蛋白质含量适宜，而且多糖和核酸含量较少，因此将其制备为待检国家标准品。

表1 候选物检定结果Table 1 Chemical composition of the national standard candidates for PPD ofMycobacterium bovisTuberculin

2.2 物理性状检验 冻干的待检国家标准品为乳白色疏松团块，加生理盐水后在5 s内溶解，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版相关规定[4]。

2.3 无菌检验 待检国家标准品无菌检验合格。

2.4 均匀性试验 稀释前和冻干后的待检国家标准品均匀性试验结果分别见表2、表3。结果表明稀释前各样品变异系数为1.4%，冻干后各样品变异系数为4.8%。稀释前和冻干后变异系数均小于5%，表明稀释前和冻干后均匀性试验重复性均较好；冻干后变异系数比稀释前的大，这说明在稀释、分装、冻干、封口、开安瓿等过程中会引入一定的试验误差，故在操作过程中，应仔细把握每一个环节，尽量减少误差。

表2 稀释前均匀性测定结果Table 2 Homogenicity before dilution

2.5 效价测定 待检国家标准品效价测定结果见表4。结果表明待检国家标准品4个稀释度引起的豚鼠皮肤红肿面积与国际标准品相对应的稀释度引起的皮肤红肿面积的差值平均值在10%以内，两者的4个稀释度的剂量反应曲线基本平行(图1)，即待检国家标准品效价与国际标准品基本相同。

2.6 稳定性试验(耐老化试验) 待检国家标准品稳定性试验结果见表5。其结果表明待检国家标准品50℃保存21 d之内效价下降程度平均值小于10%，保存28 d效价下降程度平均值大于10%。

表3 冻干后均质性测定结果Table 3 Homogenicity after lyophilization

表4 效价测定结果Table 4 The result of potency standardization

表5 稳定性试验(耐老化试验)结果Table 5 The result of stability test

2.7 特异性检验 待检国家标准品对所有试验牛和豚鼠均不产生非特异性反应。

2.8 安全性检验 用于安全性检验的豚鼠10 d内健活，待检国家标准品安全性合格。

3 讨论

结核杆菌在液体培养基内生长过程中除了产生较多的结核菌素蛋白外，还会产生一定量的多糖、核酸及残渣等物质，这些物质含量过多会影响结核菌素蛋白的生物活性。对于牛PPD中多糖和核酸的含量，《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版[4]中没有明确规定。但是作为待检牛PPD国家标准品，必须了解其中多糖和核酸的含量。人医使用的结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)对多糖和核酸的含量规定为“每1 mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1 mg”[5]，即多糖与核酸之和与蛋白质的比例不高于10%。本实验的结果符合上述规定，表明整个测定方法正确，测定结果可靠，因此可以通过收集更多的实验数据制定出牛PPD产品的多糖和核酸含量标准。

氮含量测定是研制牛PPD国家标准品关键的一步，它直接关系到随后的稀释、分装、冻干和鉴定工作。对牛PPD的氮含量测定，《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版规定的方法是凯氏定氮法，其原理是样品中的含氮有机化合物与浓硫酸共热消化，使蛋白质分解。其中氨与硫酸化合生成硫酸铵，然后加碱蒸馏释放出氨，氨用硼酸溶液吸收，再用硫酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量[7]。传统的凯氏定氮法操作比较繁琐费时，特别是蒸馏定氮过程的效率低，不利于大批样品的测定[8]。因此人们对其不断进行改进，在仪器装置的系统化方面取得了不少进展[9]。其中福斯自动定氮仪应用比较广泛。本实验使用的福斯凯氏定氮仪2300型的工作范围为0.1 mg～200 mg，满足了微量定氮的试验要求。

1个国际单位(IU)是产生生物学反应的最小单位。在本研究效价测定试验中，注射牛PPD的最小量为1.25 IU(或0.000038 mg)，国际标准品和待检国家标准品反应面积的直径都接近于能够进行有效判定的最低值(7 mm)[4]。结果表明实验的待检国家标准品前期定氮的准确性较好。

虽然生物标准物质的标定程序还没有确定，但按照WHO的要求和国家一级标准物质技术规范，应包括本实验涉及的必要步骤和程序。其中稳定性试验(耐老化试验)结果不能充分说明温度与保存时间的关系，仍需要后续试验确定两者之间的关系。

[1]李金岭，郭宏军，高明辉，等.欧盟皮内变态反应比较试验法结合ELISA检测牛结核病的研究[J].中国动物检疫，2007，24(7)：28-29.

[2]刘思国，于辉，宫强，等.牛结核病研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2003，(10)：10-14.

[3]世界动物卫生组织.陆生动物诊断试验和疫苗手册[S].农业部兽医局/中国世界动物卫生与流行病学中心译，5版，北京：人民卫生出版社，2007.

[4]农业部兽用生物制品规程委员会.中华人民共和国兽用生物制品规程[S].北京：化学工业出版社，2000.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典.第3部[S].北京：化学工业出版社，2005.

[6]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典.第1部[S].北京：化学工业出版社，2000，附录44.

[7]刘期成.试析食品中蛋白质含量的测定方法─凯氏定氮法[J].城市技术监督，2000，(7)：47.

[8]何进，梁运祥.浅谈凯氏定氮法[J].陕西粮油科技，1996，21(3)：52-53.

[9]黄晓东.凯氏定氮法的改进及其发展趋势[J].食品研究与开发，1996，17(2)：37-39.