猪圆环病毒2型感染对伪狂犬疫苗免疫应答的影响

司兴奎，张济培，陈建红，顾万军，马春全

(佛山科学技术学院 广东省高校预防兽医学重点实验室，广东佛山 528231)

自1991年Harding等首次报道猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)以来，该病已遍布全球[1]。随后Clark等人证实PMWS同猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)有关，序列比较结果显示其不同于以往污染PK-15细胞的PCV1，因此，将与引起PMWS相关的 PCV命名为 PCV2[2-3]。现已证实PCV2除被认为是PMWS的致病原外，该病毒感染还被认为与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、仔猪的先天性阵颤(CT)及母猪繁殖障碍、仔猪腹泻等疫病的发生有关，其中以PMWS危害最为严重[4]。已有研究表明PMWS病猪可表现出胸腺明显萎缩甚至消失，免疫组织器官中并指状细胞、滤泡间树突状细胞和淋巴细胞减少或衰竭，CD79α+B细胞主要依赖区域的淋巴滤泡界限模糊甚至消失，T细胞依赖的副皮质区细胞衰竭等免疫抑制性指征[5-6]。

中国作为世界养猪数量较多国家之一，PCV2感染和伪狂犬(Pseudorabies，PR)的发生均相当严重[7-11]。尽管PCV2感染情况较为普遍，但并非所有PCV2阳性猪均发展成为PMWS或PDNS，因此并未引起足够的重视。猪PR作为困扰我国养猪业发展的重要疫病之一，尽管其基因缺失弱毒疫苗在绝大多数猪场广泛使用，但仍时有PR发生。为探讨PCV2感染是否影响机体对PR疫苗体液免疫应答，本实验通过对单独接种猪PR疫苗组及先进行PCV2感染3周后再接种猪PR疫苗组后不同时相血清中猪PR特异性抗体水平进行比较研究，为阐明PCV2感染对猪PR疫苗体液免疫应答的影响提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料 PCV2 SX株由广东省高校预防兽医学重点实验室分离保存；猪PRgE/gI双基因缺失弱毒疫苗(Bartha-K61株)购自哈尔滨维科生物技术开发公司产品(200841)；猪PRV gB抗体阻断ELISA诊断试剂盒购自瑞士IDEXX生物科技有限公司产品(09732-CD383)；pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker购自MBI Fermentas生物技术有限公司产品；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技公司产品；用于对外周血T细胞进行双色分析的抗体包括：FITC标记鼠抗猪CD4单克隆抗体(MAb)和RPE标记的鼠抗猪CD8 MAb均购自美国Souther-Biotech有限公司。全自动血液分析仪(KX-21)为日本SYSMEX东亚公司产品；FACSCalibur流式细胞仪(FACS101)为美国BD公司产品；8头29日龄健康皮特兰杜洛克－长白杂交猪，购自广东省惠州某猪场。

1.2 动物试验 将8头29日龄健康杂交猪随机分为2组，严格进行隔离饲养，其中1组为单独接种猪PR疫苗组(A组，n=3)、2组为PCV2感染3周后接种猪PR疫苗组(PA组，n=5)；PA试验组仔猪在29日龄经鼻和口接种PCV2 SX株4 mL/头(TCID50为107.25/0.3 mL)，A组及PA组试验猪在50日龄时接种猪PR疫苗(试验仔猪在3日龄已进行PR疫苗滴鼻免疫)，接种剂量均为2头份/头。各组均于接种疫苗前3周、1周(简记为-3，-1)、接种疫苗时(简记为0)及接种后1周、3周、5周、7周和9周(WPI)采取EDTA抗凝前腔静脉血液，分别进行血液常规、流式细胞术分析及分离血清进行ELISA抗体检测[6]。

1.3 PCV2基因组DNA的提取 参照文献中的方法进行[12]。

1.4 检测PCV2-ORF1的PCR方法的建立 根据GenBank中登录的PCV2核酸序列，设计扩增ORF1片段的引物。引物序列为：5'-AGTGAGCGGGAAA ATGCAGA-3' 和 5'-TCCTCCGTGGATTGTTCTGT-3'。反应条件为：94℃3 min 1个循环；94℃30 s，57℃30 s，72℃30 s，35个循环；72℃10 min，反应结束。扩增产物大小为417 bp[12]。

1.5 白细胞和淋巴细胞含量的测定 采用全自动血液分析仪分别对白细胞、淋巴细胞含量进行检测。

1.6 外周血单核细胞CD4/CD8双色流式细胞术分析 利用流式细胞仪，在488 nm的氩激光波长下进行检测，对外周血单核细胞通过门技术限定于淋巴细胞，分别对CD4+/CD8-、CD4-/CD8+及 CD4-/CD8+细胞亚群的相对含量进行检测[6]。

1.7 数据表示方法 根据血常规分析的淋巴细胞的含量计算出 CD4+/CD8-、CD4-/CD8+及 CD4+/CD8+细胞亚群的绝对含量(以χ±SD表示)。

1.8 检测猪PRV gB抗体的阻断ELISA方法 按照试剂盒推荐快速模式的程序进行。结果判定方法为：S/N值不大于0.6的血清样品判定为阳性，S/N值大于0.7的血清样品判定为阴性，介于阴性和阳性血清阻断值间的待检样品判定为可疑(以χ±SD表示)。

1.9 检测PCV2抗体效价的间接ELISA方法 参照文献[12]中的方法进行。

2 结果

2.1 临床表现及血清中的病毒检出情况 PA组在整个试验过程中表现同对照组基本一致。随机抽取3份感染组血清提取基因组DNA后，进行PCR检测，结果见图1。在0 WPI、5 WPI及9 WPI后均检测到PCV2 ORF1阳性片段。

2.2 白细胞和淋巴细胞含量的测定结果 采用全自动血液分析仪对A组及PA组试验猪的白细胞(简称为AW和PAW)、淋巴细胞含量(简称为AL和PAL)进行检测。由图2可见，在整个试验过程中A组及PA组不同时相的白细胞含量无显著差异，但在1WPI至3WPI期间即PCV2人工感染后4周至6周间，A组白细胞含量均高于PA组，此后除9WPI外(A组白细胞含量略高于PA组)，其余时相PA组白细胞含量甚至略高于A组，提示PCV2感染可导致白细胞含量的短时间下降，但随后变恢复至正常水平。在整个试验过程中除1 WPI和9 WPI外的所有时相PA组的淋巴细胞含量均略高于A组，提示PCV2感染对机体淋巴细胞含量并无明显影响。

2.3 外周血单核细胞CD4/CD8双色流式细胞术分析结果 采用CD4/CD8双色流式细胞术可以区分CD4+/CD8-幼稚型Th细胞、CD4-/CD8+Tc细胞及CD4+/CD8+记忆/激活Th细胞亚群。对A组及PA组外周血单核细胞中各细胞亚群的含量的检测结果(表 1)。除 3WPI时相 A组 CD4+/CD8-幼稚型 Th细胞含量略低于PA组外，在1WPI～7WPI过程中A组幼稚型Th细胞含量均高于PA组(分别简称为A4及PA4组)；而在-3WPI、-1WPI及9WPI时相，PA组幼稚型Th略低于PA组。从表1可见，在1WPI和9WPI时相，A组CD4-/CD8+Tc细胞含量高于PA组，特别是在9WPI，2者Tc细胞含量的差异显著(p＜0.05)(分别简称为 A8及 PA8组)；除 1WPI和9WPI外，PA组的Tc细胞含量均高于A组，尤其在5WPI PA组Tc细胞含量为A组的1.76倍，但2组间无明显差异。由表1可知，在整个试验过程中，PA组CD4+、CD8+记忆/激活Th细胞含量均略高于A组(分别简称为A48及PA48组)。从PA组及A组Tc、记忆/激活Th、幼稚型Th的含量变化可推断，PCV2感染后可使负责机体免疫回忆反应的记忆/激活Th细胞数量略有升高；PA组幼稚型Th细胞含量的下降表明，尽管幼稚型Th细胞未接触过抗原，但是作为效应Th细胞的储备细胞其数量的下降提示PCV2感染可以在一定程度上降低了机体T细胞和B细胞对抗原的识别功能；从总体上看，参与机体特异性细胞免疫的Tc细胞却因PCV2的感染而得以升高，但在病毒感染后期(9WPI)Tc细胞数量显著下降，提示病毒感染后期明显抑制了机体特异性细胞免疫功能。

表1 A及PA组不同时相的CD4/CD8各淋巴细胞亚群的含量(×109个/L)Table 1 The CD4/CD8 subpopulation counts of lymphocytes of group A and PA at different weeks post inoculation(×109copies/L)

2.4 检测猪PR抗体的阻断ELISA方法 对A组及PA组试验猪进行阻断ELISA检测相应的PR抗体水平(表2)。在整个试验过程中，除9WPI外，A组的S/N值均低于PA组，提示PCV2感染对机体产生针对PRV gB特异性抗体有一定的抑制作用。另外，在人工PCV2感染前两组的S/N值均符合阳性判定结果，此时并未接种PR弱毒疫苗，应归结为母源抗体水平所导致，但随后A和PA组抗体S/N值的差异进一步扩大，提示为PCV2感染所导致。

表2 A及PA组不同时相的PRV-gB抗体阻断ELISA的S/N值Table 2 The S/N ratios of PRV-gB antibody of group A and PA by blocking ELISA

2.5 检测猪PCV2抗体的阻断ELISA方法 对PA组血清抗体检测结果见表3。在0 WPI、5 WPI及9 WPI血清抗体P/N值均大于2，符合阳性判定结果。

3 讨论

尽管PCV2是否为PMWS的唯一致病原尚存在争议，但国外一些学者采用PCV2单独感染息生或SPF猪已成功复制出PMWS，而且组织病理学和流式细胞术均证实机体出现淋巴细胞减少或衰竭及胸腺萎缩等不同程度的损害，提示PCV2可以引发机体发生免疫抑制或免疫妥协[4-6，13]。在本研究中尽管采用PCV2单独感染健康猪未能复制出典型的PMWS临床症状，但是通过对接种PR疫苗组和PCV2感染并接种PR疫苗组试验猪血清中PRV gB特异性抗体水平进行比较，结果表明PCV2感染确实可以在一定程度上抑制机体对猪PR疫苗的体液免疫应答，而且在一定程度上影响机体T细胞和B细胞对抗原的识别功能功能，并在感染后期抑制了机体特异性细胞免疫功能，这也为生产亚临床型PR的发生及猪PR疫苗免疫失败提供了另外一种可能的解释。

表3 血清样品抗PCV2-ORF2抗体P/N均值和阳性率Table 3 Average P/N ratios and positive rates of antibodies for PCV2-ORF2 in sera of pigs after PCV2 infection

在中国，PCV2感染情况也相当普遍，部分省份和地区抗体或病毒核酸阳性率高达100%。而且随着其它危害猪群的主要疫病不断的得到控制，与PCV2相关疫病的危害正逐步凸现。据国外学者报道，某些病毒、疫苗或佐剂的免疫刺激可以促进PCV2感染猪发生PMWS，在我们的实验中并未发现接种猪PR疫苗对加重PCV2感染的临床症状方面的证据。

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