禽多杀性巴氏杆菌C48-3株hexABC基因缺失株的构建及其生物学特性分析

吾鲁木汗·那孜尔别克，张宇凤，龚凤娟，恩特马克·布拉提白

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

禽霍乱是一种主要由血清型A:1、A:3或A:4多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)引起的家禽和野生鸟类的接触性传染病，给养禽业造成严重的经济损失[1]。目前，预防禽霍乱的主要措施是接种禽P.multocida的灭活苗和活菌苗。研究表明，强毒株制备的灭活苗只对同源菌株的感染具有保护作用，而弱毒株制备的活菌苗虽对同源菌株和异源菌株的感染具有一定的交叉保护作用，但存在毒力返强的缺点。因此，研究禽P.multocida致病因子及其致病机理，对研制安全有效的活菌苗极为重要。

研究表明细菌荚膜是致病菌的主要毒力因子[2]。Pruimboom等的研究表明荚膜透明质酸是禽P.multocida的粘附因子[3]。Chung等的研究表明禽P.multocidaX-73株荚膜基因位点由荚膜多糖输出蛋白基因hexABCD、荚膜多糖合成酶基因hyaABCDE和荚膜多糖修饰酶基因phyAB等11个开放阅读框组成，而hexA基因的缺失突变导致禽P.multocidaX-73株对小鼠或鸡的毒力减弱[4-5]。本实验以禽P.multocida C48-3株为研究对象，采用基因敲除技术构建了hexABC基因缺失突变株，通过小鼠致病性试验检验荚膜缺陷对禽P.multocida毒力的影响，为进一步开展禽P.multocida致病机理的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒及实验动物 血清型A∶1禽P.multocidaC48-3株(CVCC458)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌DH5α、pBR322和pMD18-T载体购自TaKaRa公司；多功能低拷贝质粒pWSK29[6]由军事医学科学院微生物流行病研究所秦鄂德教授惠赠；5周龄雌性清洁级昆明系小鼠购自中南大学湘雅医学院实验动物学部。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、DNA连接试剂盒、ExTaqDNA聚合酶、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及细菌基因组提取试剂盒均购自TaKaRa公司；RNA prep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒和Quant cDNA第一链合成试剂盒购自北京天根生化科技公司；透明质酸酶购自Worthington公司；铁蛋白购自Sigma公司；DSA培养基购自Difco公司。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank中登录的禽P.multocidaPm70株全基因组序列(AF06727)、pBR322质粒序列和pWSK29质粒的多克隆位点(AF01889)，采用Primer premier 5.0软件设计3对引物(表1)，由TaKaRa公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Oligonucleotide primers

1.4 C48-3株hexABC基因的克隆和测序 将菌株C48-3接种于TB液体培养基，37℃培养18 h，采用细菌基因组提取试剂盒制备基因组DNA。以HexC-F/HexA-R为引物由C48-3株基因组DNA中扩增编码荚膜透明质酸输出蛋白A、B、C的hexABC基因。反应条件为：94℃5 min；94℃30 s、67℃30 s、72℃2 min，35个循环；72℃ 10 min。凝胶回收PCR产物，以SacⅡ和KpnⅠ进行双酶切，并连接到pWSK29质粒中，构建重组质粒pWSK29-hexABC，转化大肠杆菌DH5α。经PCR和酶切鉴定并由TaKaRa公司进行测序。

1.5 敲除质粒的构建 以Tet-F/Tet-R为引物由pBR322质粒中扩增1191 bp的四环素抗性(TetR)基因。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s、68℃30 s、72℃1 min，35个循环；72℃ 10 min。纯化PCR产物，以ClaⅠ和PstⅠ酶切并连接至重组质粒pWSK29ΔhexABC中hexC基因的PstⅠ和hexA基因的ClaⅠ位点，构建敲除质粒pWSK29ΔhexABC。经PCR鉴定并由TaKaRa公司进行测序。

1.6 突变株的构建 参照文献[7]方法制备C48-3株感受态细胞。在2.5 kV/cm、600 Ω和25 μF电转参数下，将10 μg敲除质粒pWSK29ΔhexABC电转化感受态细胞，并涂布于含有5 μg/mL四环素的DSA平板上，37℃培养48 h。随机挑取8个单菌落，以引物HexC-IN/HexA-IN进行PCR扩增。

1.7 突变株的交叉引物PCR和序列鉴定 为验证hexABC基因是否被四环素抗性基因替代而缺失，分别以引物HexC-F/HexA-R、HexC-F/Tet-R、Tet-F/HexA-R、Tet-F/Tet-R、HexC-IN/HexA-IN对突变株基因组DNA进行交叉PCR验证。同时，将以引物HexC-F/HexA-R扩增的PCR产物克隆于pMD18-T中，经PCR和酶切鉴定并进行测序鉴定。

1.8 突变株的RT-PCR鉴定 将野生株和突变株分别接种于TB培养基，37℃培养18 h，离心收集菌体，采用细菌总RNA提取试剂盒提取RNA，以其为模板采用Random Octamers和Quant Reverse Transcriptase合成cDNA第一链，并利用针对目的基因内部序列的HexC-IN/HexA-IN引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。

1.9 突变株的电镜观察 参照文献[8]方法以环氧树脂包埋菌体，制备超薄切片，水化醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察细菌荚膜结构。

1.10 突变株生物学特性研究 将菌培养于DSA平板(37℃24 h)，观察细菌菌落形态，并对单菌落进行革兰氏染色。将菌株接种于TB培养基37℃培养过夜，次日以1%接种量接种于TB培养基37℃培养，每间隔1 h测定OD600nm值，直至细菌生长处于稳定期，绘制生长曲线。

1.11 对小鼠的致病性试验 通过动物实验检测禽P.multocidaC48-3株对SPF级昆明系小鼠的半数致死量(LD50)，结果显示菌株C48-3对昆明系小鼠的LD50为6.7 cfu。将30只5周龄昆明系小鼠随机分为3组，每组10只。C48-3株和突变株在TB培养基中培养至OD600nm值为1.0，稀释制备3.45×103cfu/mL的菌液，取0.1 mL(50 LD50约为345 cfu)腹腔注射小鼠，阴性对照组小鼠腹腔注射相同体积的TB培养基，连续观察7 d，记录小鼠死亡情况。

2 结果

2.1 C48-3株hexABC基因的序列分析 以引物HexC-F/HexA-R由C48-3株基因组中扩增出大小约为2000 bp的DNA片段(图1)，与预期值相符。DNA测序结果表明，重组质粒pWSK29-hexABC含有2073 bp的插入片段，其 5'端含有 620 bp的hexC基因下游序列、中间含有798 bp的hexB基因全序列、3'端含有660 bp的hexA基因全序列，与已报道的禽 P.multocidaX-73株[7]和 Pm70株 hex-ABC基因核苷酸序列同源性为99%。并且C48-3株hexC基因终止密码子与hexB(JF276224)基因的起始密码子间存在1个碱基重叠，hexB基因的终止密码子与hexA(JF276225)基因起始密码子间存在4个碱基重叠。

图1 禽P.multocidaC48-3株hexABC基因片段的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of thehexABCgenes from avian P.multocidaC48-3

2.2 敲除质粒的构建 以引物Tet-F/Tet-R由pBR322质粒DNA中扩增出1191 bp的TetR基因，并连接至重组质粒pWSK29-hexABC的ClaⅠ和PstⅠ位点，构建敲除质粒 pWSK29ΔhexABC。以引物HexC-F/HexA-R由重组质粒pWSK29-hexABC和敲除质粒pWSK29ΔhexABC中分别扩增出大小约为2000bp和1900 bp的DNA片段，以引物Tet-F/Tet-R从敲除质粒pWSK29ΔhexABC中扩增出大小约为1200 bp的片段，与预期值相符(图2)。DNA测序结果表明，TetR基因的上游存在366 bp的hexC基因同源序列，下游存在366 bp的hexA基因同源序列。结果表明构建了敲除质粒pWSK29ΔhexABC。

2.3 突变株的构建 将敲除质粒pWSK29ΔhexABC电转化C48-3株感受态细胞，转化子涂布于含有四环素的DSA平板上培养，以引物HexC-IN/HexA-IN对疑似突变株进行菌落PCR筛选。PCR结果显示，以引物HexC-IN/HexA-IN从野生型C48-3基因组中扩增出约1300 bp片段，在8个转化子中有3个菌株扩增结果为阴性，选择1株疑似突变株做进一步验证。

2.4 突变株的鉴定 通过交叉引物PCR鉴定突变株的基因组DNA。以引物HexC-F/HexA-R扩增出约为1900 bp的片段，以引物HexC-F/Tet-R或Tet-F/HexA-R扩增出约1500 bp的片段，以引物Tet-F/Tet-R扩增出约1190 bp的片段，以引物HexC-IN/HexA-IN未能扩增任何片段，表明同源重组可能产生(图3)。同时，对引物HexC-F/HexA-R扩增得到的PCR产物进行克隆，转化大肠杆菌DH5α，并对重组质粒进行测序。测序结果表明，通过同源重组从突变株基因组中敲除253 bp的hexC基因下游序列、798 bp的hexB基因全序列和290 bp的hexA基因上游序列。这些结果表明通过基因敲除技术构建了C48-3株的hexABC缺失突变株，并命名为C48-3ΔhexABC。

图2 敲除载体pWSK29△hexABC的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of the knockout vector pWSK29△hexABC

图3 突变株C48-3△hexABC基因组DNA的交叉PCR鉴定Fig.3 Cross-PCR analysis of genomic DNA from mutant C48-3△hexABC

2.5 突变株的RT-PCR鉴定 采用逆转录酶分别对突变株和野生株RNA进行cDNA合成，并以其为模板，采用针对目的基因内部序列的引物HexCIN/HexA-IN进行PCR扩增。通过RT-PCR从野生株C48-3中扩增出约1300 bp的片段，表明hexABC基因正常转录；而在突变株C48-3ΔhexABC中为阴性，在转录水平上表明敲除了hexABC基因(图4)。

图4 突变株C48-3△hexABC的RT-PCR鉴定Fig.4 RT-PCR analysis of mutant C48-3△hexABC

2.6 突变株的电镜观察 野生株C48-3细胞壁表面存在较完整的荚膜层，但突变株C48-3ΔhexABC细胞壁表面未见荚膜结构(图5)。表明hexABC基因的缺失突变打断了荚膜透明质酸的胞外运送，这一结果也从细胞水平上证实敲除了hexABC基因。

图5 野生株C48-3(A)和突变株C48-3△hexABC(B)的电镜观察Fig.5 Electron micrographs of ferritin-stained thin section of P.multocidaC48-3(A)and mutant C48-3△hexABC(B)

2.7 突变株生物学特性分析 将菌株接种于DSA平板37℃培养过夜，观察菌落形态特征。结果显示，野生株和突变株在DSA平板上的菌落均为淡灰白色、圆形、边缘整齐，与野生株相比，突变株长出非粘性小菌落。革兰氏染色显示，野生株和突变株均为阴性，菌体形态为球杆状或短杆状，外观无明显变化。野生株C48-3和突变株C48-3ΔhexABC生长特性的比较结果表明两者生长速率无明显差异，但突变株对数期生长速率迟缓，进入平台期的细菌密度值比野生株低(图6)。

图6 野生株C48-3和突变株C48-3△hexABC的生长曲线Fig.6 Growth curves ofP.multocidaC48-3 and mutant C48-3△hexABC

2.8 对小鼠致病性试验 野生株C48-3注射组10只小鼠在感染后第2 d开始死亡，至第3 d小鼠全部死亡，剖检死亡小鼠肝脏、肾脏和肺等主要器官出现不同程度的出血；突变株C48-3ΔhexABC注射组的10只小鼠均未表现任何发病症状，健康状况良好；阴性对照组小鼠状态均良好。结果表明荚膜缺陷突变株丧失了对小鼠的致病性。

3 讨论

Chung等采用PSORT软件预测X-73株Hex-ABCD蛋白的分选信号和分布位置，结果显示，HexA蛋白可能是具有ATP结合功能的荚膜多糖输出蛋白，HexB蛋白是具有荚膜多糖输出功能的内膜蛋白，而HexC蛋白和HexD蛋白分别为内膜蛋白和外膜蛋白，但它们的生物学功能尚不清楚[5]。Chung等利用基因敲除技术构建X-73株hexA基因的缺失突变株并检测其对小鼠的致病性，结果显示突变株对小鼠的毒力降低了106倍[9]。

本研究由禽P.multocidaC48-3株基因组中扩增出hexABC基因片段，并对PCR产物进行克隆和测序，结果显示被克隆的DNA片段含有hexAB基因的全序列和hexC基因的部分序列，与已发表的禽P.multocidaX-73株[5]和Pm70株[6]hexABC基因的同源性均为99%，表明hexABC基因在血清型A∶1和A∶3禽P.multocida菌株中具有很高的同源性。为进一步研究荚膜的致病性，采用基因敲除技术构建禽P.multocidaC48-3株hexABC基因的缺失突变株，对突变株进行的PCR、RT-PCR和DNA测序结果表明突变株构建成功。电镜观察结果显示，与野生株C48-3和Chung等[9]构建的突变株PBA930相比，突变株C48-3ΔhexABC的菌体表面未见荚膜结构，显示除hexA基因外，hexBC基因也在荚膜多糖的胞外运输过程中发挥一定的作用。生物学特性比较显示，与野生株相比突变株在DSA平板上长出非粘性小菌落，对数期生长速率迟缓，而它们的菌体外观无明显变化。小鼠的致病性试验结果表明，hexABC基因的缺失突变显著影响禽P.multocidaC48-3株的毒力，即小鼠接种345 cfu的突变株C48-3ΔhexABC时未能导致小鼠的死亡，而Chung等经腹腔注射小鼠1.3×108cfu的hexA基因的缺失突变株PBA930时仍未导致小鼠死亡[9]，由此可以推测本实验所使用的突变株菌量尚未达到小鼠死亡的剂量。鉴于鸡为血清A∶1禽P.multocida的天然宿主，本实验还需要通过SPF鸡模型对hexABC基因做进一步研究，以期阐明荚膜在禽P.multocida致病过程中的作用，为禽P.multocida致病机理的研究和防治提供参考。

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