胸膜肺炎放线杆菌铁离子摄取的分子机理

肖国生，李 娟，黄小波，曹三杰，文心田

(1.重庆三峡学院生物系，重庆 404000；2.四川农业大学动物医学院基因芯片实验室，四川雅安 625014）

胸膜肺炎放线杆菌铁离子摄取的分子机理

肖国生1*，李 娟1，黄小波2，曹三杰2，文心田2

(1.重庆三峡学院生物系，重庆 404000；2.四川农业大学动物医学院基因芯片实验室，四川雅安 625014）

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App）是猪胸膜肺炎的病原，可引起各种年龄的猪发病[1]。目前，App有2个生物型和15个血清型：1型～12型、15型为生物I型，13型和14型为生物II型[2]。所有血清型均能引起猪发生胸膜肺炎，但生物II型比生物I型的毒力弱，有些血清型毒力明显更强[1，3]。App致病性强，可通过空气传播，各血清型之间交叉保护力低。因此，很难被有效控制，给养猪业造成了严重的经济损失。

App作为一种高致病性病原，引起猪发病需要经过定植、逃避宿主防御和损伤宿主组织3个基本阶段[1]。当该菌粘附于猪呼吸道上皮细胞后，其定居部分取决于细菌获取生长所有必需营养成分的能力。铁离子是细菌生长必需的元素，铁离子常在Fe-S原子簇中与硫结合，作为不同功能酶的催化中心，参与呼吸、ATP合成、DNA复制和修复等。另外，铁离子也是一种调控许多毒力因子表达的环境信号分子。但是，在宿主体内，胞外铁离子常与糖蛋白、乳铁蛋白和转铁蛋白等外分泌腺分泌物结合，而大部分胞内铁离子则以亚铁血红素的蛋白形式存在，如血红蛋白(Hb）[2]。这种多方式螯合作用降低了自由铁离子的浓度，其浓度可低于10-24M，远低于维持细菌生长的水平(10-6～10-8M）[2，4]。App为了抵抗宿主对铁离子的限制，能在宿主体内生存，细菌表达多种与铁离子摄取有关的因子，进化形成了多种具有高亲和性的获铁系统以帮助它从猪体内摄取生长所必需的铁离子。这些获铁系统都是TonB依赖的，TonB作为能源有促进从细胞表面结合有铁螯合物的外膜蛋白中铁离子的吸收。转铁蛋白、Hb或嗜铁素中的铁离子跨外膜运输都依赖于ExbB-ExbD-TonB系统。位于细胞质膜的Exb-TonB复合体将来自质子动力势的能量转移至外膜上的铁受体，一旦配体与铁受体结合，诱导构象发生变化，构象的变化给配体-受体发出信号，要求依赖TonB的能量转移[2]。目前，从App中鉴定出2种TonB系统：TonB1系统与tbpBA相关，其基因簇为tonB1-exbB1-exbD1，是该菌特有的；TonB2系统对于App生长在以血红素、猪Hb或铁色素(Ferrichrome）作为唯一铁源是必需的，其基因簇为exbB2-exbD2-tonB2。TonB2毒力作用远大于TonB1[5]。该菌充分利用宿主内源性铁(转铁蛋白、Hb）和外源性铁源(嗜铁素、螯合铁），在能源系统和铁摄取因子的帮助下通过获铁系统摄取铁离子以克服在感染期缺铁对细菌生存的影响[2，6-7]，见图 1。

1 利用转铁结合蛋白摄取铁离子

App的转铁结合蛋白(Tbp）是一种结合转铁蛋白的受体，具有宿主专一性，只对猪的转铁蛋白具有特异性结合。这个铁摄取系统由2个铁离子可抑制性表面成分组成：一个是TbpA蛋白，也称Tbp1或TfbB，分子量为100 ku，其功能是构成铁离子通过外膜的跨膜通道；另一个蛋白是TbpB，也称Tbp2或TfbA，分子量为60 ku，属脂蛋白，锚定在外膜上，起辅助分子的作用[8-9]。TbpB在不同血清型间表现出高度的差异，具有型特异性免疫反应[6]。2种蛋白都可从细胞表面与猪转铁蛋白的C形部位结合，但只有这2种蛋白相互作用才能最佳利用转铁蛋白，并以此作为唯一铁源[10]。TbpB也能与血红素结合[9]。在该菌中tbpA和tbpB基因与exbBD1基因相连，呈共转录[5，11]。ExbB1和ExbD1形成一个内膜蛋白复合体，与TonB1相连，为受体提供能量使铁离子通过外膜，对于该菌利用转铁蛋白中的铁离子是必需的。exbB1和tonB1双转座子突变株无毒力，说明ExbB1-exbD1-TonB1复合体在铁离子摄取中扮演重要作用[12]。Tbps在该菌感染过程中表达却下调[13]。因此，其它获铁系统在该菌感染后期是必要的。

2 利用血红蛋白受体摄取铁离子

在限铁条件下，从App外膜蛋白中纯化获得2种分子量大约为75 ku和105 ku的血红蛋白结合蛋白，为非脂蛋白[14]。75 ku蛋白除能结合Hb外还能结合血红素，与其它革兰氏阴性菌的铁调控外膜蛋白、转运蛋白和TonB依赖受体有一致性[2]。105 ku蛋白为App的血红蛋白受体(HgbA），与巴氏杆菌科的HgbA有很高的同源性。hgbA基因长2 838 bp，蛋白分子量为104.9 ku，由946个氨基酸组成，含有一个23氨基酸的信号肽，HgbA突出于外膜的结构为环状结构，可能具有与Hb和亚铁血红素结合的功能[15]。hgbA基因存在于所有1型～15型菌株中，具有保守性，而HgbA负责从Hb中获取铁离子。hgbA基因缺失突变株不能在仅有Hb作为铁源的培养基中生长，Hb的利用被阻止[15，16]，且其毒力减弱，HgbA对该菌的毒力起到了一定作用[17]。但HgbA是以何种方式将Hb中的血红素转运至周质，是否还需要其它蛋白共同介导血红素的转运仍不清楚。

HgbA是App唯一的血红蛋白受体，但不是唯一能结合Hb的物质，75 ku外膜蛋白和LPS也能与Hb发生结合[14，18]。Deslandes等研究该菌在限铁环境下基因转录谱时发现了一个新的基因簇，由2个ORFs组成，它们与脑膜炎奈氏球菌(N.meningitides）的血红蛋白受体(HmbR）有43%的一致性，HmbR对Hb具有高亲和性，能剥夺Hb中的血红素，然后将血红素转运到周质内[19]。经推定，胸膜肺炎线杆菌的HmbR的分子量为76.7 ku[19]，与75 ku蛋白分子量接近。但App的HmbR是否与脑膜炎奈氏球菌的HmbR一样参与铁离子的获取，与已知的75 ku蛋白是否为同种蛋白，待进一步证实。

3 利用嗜铁素受体摄取铁离子

App除可利用Tbp和HgbA 2个获铁系统从宿主内源性含铁物质中获取铁离子外，还可以利用嗜铁素受体(FhuA）从含铁的嗜铁素中摄取铁离子，从而满足细菌生长的需要[7]。嗜铁素(Siderophores）是好氧菌和兼性厌氧菌的一种产物，在低铁离子条件下产生的，分子量小于1 ku，为特异的高亲和性铁螯合剂，能与乳铁蛋白和转铁蛋白竞争铁离子。Fhu系统也是TonB依赖，由fhuC、fhuD、fhuB和fhuA 4个基因组成一个Fhu操纵子，编码的蛋白与大肠杆菌等其它几种细菌的Fhu系统的蛋白同源[20]。fhuA基因长约2 088 bp，其推导的FhuA蛋白分子量为74.75 ku，为一种嗜铁素受体，属外膜蛋白，具有与TonB结合的结构，在体内表达。与其它铁摄取系统不同，细菌在低铁离子的环境中生长其fhuA基因的表达并不上调，而且不被铁离子调控[21]。fhuA在1型～15型中保守，fhuA突变株与原代株毒力没有变化，说明不是App毒力的必要成分[17，22]，但当fhuA缺失后其它铁摄取系统不受影响，而铁色素的吸收停止[21]，FhuA对细菌性外源异羟肟酸铁(Ferric hydroxamate）类物质具有特异性[20]。fhuD基因长954 bp，编码的FhuD蛋白分子量为35.6 ku，属周质蛋白，负责将异羟肟酸铁从外膜转运至内膜；fhuC基因长765 bp，编码的FhuC蛋白分子量为28.5 ku，fhuB基因长1 953 bp，编码的FhuB蛋白分子量为69.4 ku，FhuC和FhuB属质膜结合蛋白，为转运体家族成员。FhuC和FhuB是将异羟肟酸铁内化的ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC）转运体的组件[17，20]。

4 Yfe获铁系统

Deslandes等研究发现在App中可能还存在一个Yfe-ABCD系统，它的基因在限铁时表达上调，其蛋白分别与多杀性巴氏杆菌的YfeABCD有63%、76%、75%和66%的同源性[19]。Yfe系统具有利用螯合铁的功能[23]。App的Yfe系统的各基因排列与多杀性巴氏杆菌的同源基因不同，yfeB在yfeA的下游，在yfeA上游还有3个ORFs，紧接着反向有2个ORFs，命名为omp64，在第二个omp64下游160 kb才是yfeCD基因[19]。据推导，YfeA为螯合铁ABC转运体，属周质结合蛋白，目前无法准确定位，但预测不会在胞质内；YfeB为螯合铁转运体，属ATP结合蛋白；YfeCD为螯合铁转运组件，属膜蛋白，位于胞质膜；Omp64为外膜蛋白，为TonB依赖性受体，位于细胞外膜。根据蛋白功能的推测，YfeABCD-Omp64可能是该菌一个新的获铁系统，负责转运螯合铁中的铁离子，但这个系统中各蛋白的更详功能和定位尚不清楚。

5 Afu转运系统将铁离子转运至细胞质

一旦铁离子从外膜运至周质，要到达细胞质一般都由周质结合蛋白依赖的铁转运系统介导完成[1-2]。从App中鉴定出一个afuABC操纵子，它编码一个ABC转运系统，与已知的周质结合蛋白依赖的铁转运系统同源[24]。afuA基因长1 041 bp，编码的AfuA蛋白为周质铁结合蛋白，由346氨基酸组成；afuB基因长2 064 bp，编码的AfuB蛋白由663个氨基酸组成，有24个前导序列，是一个高疏水的胞质膜整合蛋白，含有2个一致的透明质酸酶基序，基序位于胞内环，与ATP结合蛋白相互作用；afuC基因长1 047 bp，编码的AfuC蛋白由348个氨基酸组成，是一个亲水的外周质膜蛋白，含有ATP结合基序[24]。仍不清楚该铁转运系统是否为该菌唯一一个负责转运铁离子通过胞质膜的铁转运系统。

6 脂多糖(LPS）在App捕获铁离子中的作用

LPS属细胞表面多糖，已知含有3个区：脂质A、寡糖核心和O-抗原。LPS主要起到粘附的毒力作用，使App粘附于猪呼吸道上皮细胞[1-2]。LPS除了具有粘附的毒力作用外，还能结合猪Hb[25]。O-抗原多变，与毒力无关，而寡糖核心是细菌粘附细胞的必需组件，LPS核心突变株则完全无毒[2，26]，而与猪Hb结合的区域是脂质A[25]。LPS与猪Hb结合后能影响LPS某些物理和生物学特性，但与猪Hb结合的具体作用仍不清楚，也许LPS对猪Hb只是起到一个非特异性结合受体的作用，或在铁转运过程中起到一个“码头”作用，一旦LPS与猪Hb结合后，猪Hb被转移到特异性受体上，如HgbA[18]。然而，LPS结合猪Hb后是如何参与随后铁离子的摄取和转运，同时还需要哪些外膜蛋白和周质蛋白仍需进一步研究。

7 Apx外毒素在细菌捕获铁离子中的作用

App可以分泌4种不同的外毒素：ApxI、ApxII、ApxIII、ApxIVA，它们是引起猪发病的最重要毒力因子[27-28]。ApxI(105 ku）具有强溶血活性和细胞毒性；ApxII(103 ku～105 ku）具有弱溶血活性和中等细胞毒性[27]；ApxIII(120 ku）不能溶解猪红细胞，但对肺泡巨噬细胞和多核白细胞有很强的细胞毒性[27]；ApxIVA(170 ku～202 ku）只能在体内表达，具有强免疫原性和弱溶血性[28]。Apx外毒素在该菌捕获铁离子过程的作用可能主要是裂解红细胞释放Hb和血红素，为细菌提供必要的内源性铁源，然后通过HgbA、LPS和OMP等获取其中的铁离子。但是在转录表达研究中发现，在限铁离子环境下只有apxIC基因表达呈轻微上调，而apxIABD并不超表达[19]。

8 其它可能与铁离子摄取有关的因子

随着对App全基因组及其基因表达研究，发现有更多的基因参与铁离子摄取和调控。Deslandes等研究发现，该菌在限铁离子环境下生长至少有210个基因表达存在差异，其中92个基因表达上调[19]，可能还存在尚未被发现的铁摄取系统和因子。在研究中他们还发现了一个由4个ORFs组成的基因簇，第一个ORF命名为fetB2，编码一个独特的蛋白，预测其定位于周质，与周质金属结合蛋白TroA超家簇有相似性[19]。通过序列分析，与其它已知和推测的周质结合蛋白同源，许多同源的周质结合蛋白参与铁离子的转运。fetB2下游的3个ORFs可能编码ABC转运体的成分，下游第3个ORF可能编码ATP酶的成分，可能定位于周质或细胞质内；其它2个ORFs可能位于周质内[19]。fetB2是否为儿茶酚型嗜铁素(Catecholtype siderophore）获铁系统的组成部分还需进一步鉴定[19]。

9 结束语

App能表达 Tbp、HgbA、LPS、OMP、Fhu、Afu和Yfe等多种因子参与铁离子的摄取，进化形成了完善的铁摄取系统来抵抗在感染过程中缺铁对细菌生存造成的影响。在该菌中可能还存在其它尚未被发现的铁离子摄取因子，并且在已知的这些因子中仍有许多功能并不十分清楚。例如，HgbA是以何种方式将Hb中的血红素转运至周质，是否还需要其它蛋白共同介导血红素的转运？LPS是以何种方式参与铁离子的摄取，结合猪Hb的具体作用?75 ku外膜蛋白、HmbR、Yfe和FetB2等因子的具体功能和准确定位等都有待深入研究。通过对细菌铁离子摄取因子及其机制的深入了解，将有助于阐明App的致病机理，获得有效的免疫成分和采取有效的预防措施。

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S852.61

B

1008-0589(2010）01-0077-04

2008-11-01

重庆市教育委员会科学技术研究项目(KJ081108）；重庆三峡学院科研项目(2007-SXXYYB-02）；重庆市万州区科委项目(20081022）

肖国生(1972-），男，重庆奉节人，博士，副教授，从事微生物与分子生物学研究.

*通信作者：E-mail：xgs03@163.com

(本文编辑：赵晓岩）