日本血吸虫Wnt受体蛋白SjFz5在不同发育阶段的组织定位及mRNA表达水平分析

信彩岩，王孝波，冯新港，高 阳，石耀军，杨健美，王立群，苑纯秀*

(1.东北农业大学生命科学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院上海兽医研究所农业部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241)

血吸虫病是由血吸虫感染引起的分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。目前全球针对血吸虫病实施的是以吡喹酮化疗为主的综合防治策略，而血吸虫对该药物产生耐药性的可能性已不容忽视[1-2]。发现新的药靶，推进新的安全高效的抗血吸虫药物的研发是当务之急。Wnt信号通路是细胞发育和生长调节的关键途径，胚胎发育早期该通路的异常调节可能导致胚胎畸形甚至死亡。目前多种肿瘤和疾病的发生已确定与成体内Wnt信号通路的异常激活相关[3]。在人类疾病，特别是肿瘤研究方面，以Wnt通路成员作为药物靶标探索抗肿瘤药物一直是研究热点[4-5]。Frizzlded蛋白是七次跨膜蛋白，是Wnt信号通路信号传递必不可少的受体[6]，属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)超家族成员。根据生物体自身发育的需要，Frizzled蛋白通过与特定的Wnt受体结合启动相应的信号传递，调节靶基因的表达，最终产生相应的生物学效应。市售药品中有约30%～50%是以GPCR家族成员作为确定的药靶[7]。本实验室在前期工作中获得了日本血吸虫(Schistosoma japnicum，Sj)的 Fz5(SjFz5)基因(EU370926)[8]，属于首次在血吸虫中发现的frizzld家族成员。脊椎动物中的研究发现，Fz5介导的信号通路的调节功能在不同物种和不同组织间是存在差别的。Fz5受体在爪蟾、斑马鱼、鸡和小鼠的早期胚胎发育过程中几乎是专一性表达在眼部，Fz5的缺失会导致爪蟾[9]、斑马鱼[10]和鸡[11]眼睛的异常发育。但Fz5基因敲除小鼠的研究发现，Fz5的缺失首先导致胚胎发育早期卵黄囊和胎盘血管发生缺陷，间接导致眼睛的不良发育[12]。Fz5在低等的无脊椎动物中功能研究尚未见报道，本研究对SjFz5基因进行了结构、mRNA表达及组织定位分析，为探讨其生物学功能及作为生物药靶的可能性提供实验数据。

1 材料和方法

1.1 Sj尾蚴及实验动物 Sj安徽株尾蚴由血吸虫病研究室的钉螺室提供；新西兰兔(体质量：2.5 kg～3.0 kg)购自上海罗泾飞达实验动物养殖场。

1.2 主要试剂和仪器 TRIzol Reagent RNA提取试剂盒和SuperScriptTMⅢReverse Transcriptase购自Invitrogen公司；SYBR®Premix ExTaqTM(Perfect RealTime)、PrimeScriptTMRT reagentKit 购 自TaKaRa公司；IRDyeTM800标记的羊抗小鼠IgG(IRDye-IgG)购自上海吉泰生物科技有限公司；小鼠SP检测试剂盒购自北京中杉金桥生物公司；双色红外激光成像仪为Odyssey公司产品。

1.3 不同发育阶段的Sj收集 将Sj安徽株尾蚴感染新西兰兔，腹部贴片，感染2000条～10000条尾蚴/只。分别在感染后 7 d、13 d、18 d、23 d、29 d、32 d、42 d剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体。将23 d及以后各发育阶段的虫体雌雄分开。收取感染后42 d的兔肝剪碎、匀浆进行多重筛网过滤，纯化并收集肝虫卵，于液氮中冻存备用。

1.4 总RNA的提取及cDNA的合成 按TRIzol试剂盒说明书抽提虫卵及收集的各期别、性别虫体总RNA，置-80℃冰箱冻存备用。取抽提的各期别、性别的总RNA，按照SuperScriptTMⅢReverse Transcriptase试剂盒手册，反转录合成cDNA，作为PCR扩增的模板。

1.5 SjFz5基因编码蛋白的生物信息学分析 利用在线分析工具 SignalP，THMMHT和 NetAcet对SjFz5基因编码蛋白的一级结构进行预测分析。

1.6 SjFz5在Sj不同发育阶段mRNA转录水平分析 按照定量PCR的引物设计原则，设计SjFz5引物，上游引物：5'-ATGGCATCATCTGTTTGGTG-3'；下游引物：5'-TAGCTTGGGAACCAGGAAAG-3'。选择18S rRNA(AY157226.1)作内参，上游引物：5'-TTAGTTGGTGGAGCGATTTGTCTGG-3'；下游引物：5'-CTGTTATTGCTCAATTTCGTGCGAC-3'；引物由Invitrogen公司合成。参照PrimeScriptTMRT reagent Kit说明，将RNA反转录成cDNA，以SYBR GreenⅠ为荧光染料， 用SYBR Green PCR Premix ExTaq进行实时定量PCR扩增。反应条件为：95℃ 10 s；95℃ 5 s、55℃ 15 s、72℃ 20 s，40个循环。每个样品均做3个重复。以7 d童虫cDNA作10倍系列稀释后为模板，构建SjFz5和18S rRNA内参的标准曲线。保证每个标准曲线的相关系数R2>0.99，采用相对定量法得到不同期别相对每百万18S rRNA内参基因的SjFz5的拷贝数。

1.7 SjFz5基因胞外CRD区原核重组表达质粒的构建 参考文献[13]的研究思路，构建SjFz5分子胞外CRD区段的重组表达质粒，进行蛋白的表达纯化，作为制备针对SjFz5蛋白多抗的免疫原。设计引物序列，上游引物：5'-GTGGATCCGATAATCAT CAATTGAATCATGTAG-3'(BamHⅠ)；下游引物：5'-GTCTCGAGTCCTTCTGGTAATAAATCACAAT-3'(XhoⅠ)，理论扩增片段为543 bp。引物由invitrogen公司合成。以第7 d Sj总RNA反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆到pET28a(+)中，并将重组质粒命名为pET-SjFz5-CRD。

1.8 pET28a-SjFz5-CRD在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析 将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导。SDS-PAGE电泳分析经超声破碎后的菌液蛋白，判断蛋白是以可溶性或包涵体形式表达。参照Ni亲和柱蛋白纯化说明书进行重组蛋白的纯化，对于包涵体表达，将纯化的蛋白经梯度摩尔浓度的尿素透析进行复性：6M-4M-2M-1M-1×PBS。将纯化蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移到硝酸纤维(NC)膜上，以1∶50稀释Sj虫卵蛋白免疫兔血清作一抗，以羊抗兔HRP-IgG(1∶2000)作二抗，用增强型HRP-DAB显色试剂显色分析重组蛋白的免疫原性。

1.9 SjFz5蛋白多克隆抗体的制备 将纯化后的重组蛋白调整为1 mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂混合乳化进行首免，背部皮下多点注射6周龄～10周龄BALB/c雄性小鼠，每隔两周加强免疫，免疫剂量及途径同于首免，所用佐剂为弗氏不完全佐剂。在第3次免疫后一周进行采血，分离血清。

1.10 SjFz5蛋白多克隆抗体的特异性分析 按照动物细胞(组织)总蛋白抽提试剂盒(Ⅰ型)(DBI)说明书，抽提冻存的18 d虫体蛋白，并进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移到硝酸纤维(NC)膜上。以SjFz5-CRD重组蛋白免疫多抗(1∶500)作一抗，以羊抗小鼠IRDye-IgG(1∶15000)作二抗进行western blot分析，同时设置阴性血清作对照，通过Odyssey红外荧光扫描成像系统分析结果。

1.11 SjFz5蛋白在Sj体内的组织定位 收集13 d、17 d童虫及23 d、29 d、35 d、42 d新鲜虫体，23 d后虫体雌雄分开，4%的多聚甲醛固定后，进行常规石蜡包埋切片。参考《免疫组织化学实验技术及应用》[14]进行免疫组化试验，采用沸水浴20 min进行热修复，滴加SjFz5-CRD重组蛋白多抗及阴性血清采用1∶400稀释。其余操作按小鼠SP-9002检测试剂盒说明进行,加加入DAB边观察边显色，一旦着色即用蒸馏水洗涤终止。苏木素复染20 s，自来水冲洗10 min，封片，镜下读片。

2 结果

2.1 SjFz5蛋白的结构 软件分析显示，SjFz5具有frizzled家族蛋白的典型结构：(1)氨基端具有信号肽序列，裂解位点在23 aa和24 aa之间；(2)aa 97～aa 212为保守的CRD区，包含10个保守的半胱氨酸；(3)胞外区具有潜在的糖基化位点，分别位于aa 110～aa 112和aa 550～aa 552；(4)具有7次跨膜结构；(5)第7个跨膜结构的两个氨基酸之后具有731KTXXXW736的保守基序。

2.2 SjFz5在Sj不同发育阶段mRNA水平表达分析 图1所示为SjFz5的mRNA在Sj不同发育阶段的相对表达水平。由于18 d前的虫体较小，雌雄难以区分，采用雌雄混合虫体进行分析，23 d及其后的成虫雌雄分开后分别进行分析。SjFz5mRNA的表达谱显示：虫体发育早期的表达量较高，其中7 d时的表达水平最高，之后的13 d、18 d下调了约1/3，13 d和18 d之间的表达水平相差不显著。23 d及其后的雌虫SjFz5mRNA表达水平明显下调，并维持在较低的水平。23 d及其后的雄虫SjFz5mRNA下调比雌虫略显缓慢，在26 d及其后的雄虫各阶段维持在较低的水平。雌雄虫间比较，SjFz5mRNA在雄虫体内的表达水平普遍高于雌虫，差异水平在2倍～4倍之间不等。

图1 SjFz5基因在日本血吸虫不同发育阶段的mRNA的表达水平差异分析Fig.1 Analysis ofSjFz5mRNA expression in parasites at different development stages

2.3 pET-SjFz5-CRD的构建、重组蛋白的纯化及免疫原性分析 经菌液PCR、重组质粒双酶切和测序证明重组质粒构建正确。将重组质粒转入BL21(DE3)，经SDS-PAGE分析重组菌诱导表达产物约26 ku，与预测分子量29.4 ku相符(图 2A)。SDSPAGE分析表达菌体裂解上清及沉淀，显示该重组蛋白主要以包涵体形式存在。参照Ni亲和柱使用说明书中变性蛋白的纯化方法，纯化尿素溶解的包涵体蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳进行检测(图2B)。重组蛋白的western blot结果显示：在约26 ku处有一明显的识别条带，大小与目的条带相符(图2C)，表明重组蛋白具有良好的抗原性。

图2 SjFz5-CRD在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE(A、B)和 western blot(C)分析Fig.2 SDS-PAGE(A,B)and western blot(C)analysis of SjFz5-CRD expression inE.coli

2.4 SjFz5多抗的特异性分析 对Sj虫体蛋白进行western blot分析，结果显示：SjFz5蛋白的抗血清能够与虫体天然蛋白中单一蛋白条带发生反应，该条带大小与SjFz5蛋白的理论预测分子量相一致，而阴性血清对照组无特异条带出现(图3)。表明制备的SjFz5-CRD重组蛋白多抗能够特异地识别天然虫体中的SjFz5蛋白，可用于SjFz5蛋白的免疫组织定位分析。

图3 以血吸虫天然虫体蛋白鉴定制备的SjFz5多抗血清Fig.3 Identification of produced polyclonal serum against SjFz5with natural protein ofS.japonicum

2.5 SjFz5蛋白在虫体不同发育阶段的组织定位以SjFz5蛋白抗血清作一抗进行免疫组化反应，DAB染色显示定位结果。如图4所示，在13 d至42 d各发育阶段的虫体切片上，SjFz5蛋白均呈现广泛分布。在虫体的口吸盘、腹吸盘、体壁肌细胞层等呈阳性着色，而以阴性血清作一抗的切片只见细胞核蓝染。另外，在雌虫卵细胞、卵黄细胞以及雄虫的精细胞中均可见明显的阳性反应(图5)，而相应的阴性血清对照组没有表达信号。与17 d的虫体切片(5A，5G)相比，23 d及之后各发育阶段的雌虫卵巢(5B，5C，5D，5E)和雄虫睾丸(5H，5I，5J，5K)中SjFz5蛋白的分布数量明显增多。在雌虫的卵巢上，较小的初级卵细胞中阳性着色密集，呈实心球样。而较大的发育较成熟的卵细胞中可见阳性颗粒在细胞四周排列成环状。SjFz5蛋白在虫体各类细胞膜中的跨膜分布在100倍的油镜下清晰可见(图6)。

3 讨论

图4 SjFz5在各期别虫体上的组织分布(×400)Fig.4 The distribution of SjFz5 in different development stage(×400)

Frizzled蛋白作为跨膜受体，是Wnt信号通路进行信息传递不可缺少的。Frizzled在不同的发育阶段具有不同的时空表达模式，以传递相应的发育信息。抑制Frizzled蛋白的正常表达，会导致生物发育发生异常。如正常发育小鼠的Fzd5基因mRNA，在胚胎发育第9.5 d时表达在卵黄囊、眼睛和肺芽组织中。纯合的Fzd5基因敲除小鼠，因卵黄囊血管发生缺陷，致胚胎发育至10.75 d时死亡[12]。了解特定Frizzled蛋白的时空表达模式，有助于了解其功能。本研究显示SjFz5的mRNA在血吸虫童虫阶段的表达水平最高，相应的免疫组化结果也显示，在童虫的口腹吸盘、体壁肌肉组织等部位SjFz5蛋白分布密集。推测SjFz5蛋白介导的信号通路可能在童虫阶段调控细胞的增殖、器官的分化发育。与童虫阶段相比，23 d之后成虫的SjFz5mRNA表达明显下降，在整个成虫阶段以一个较低的水平维持。对照相应发育阶段的免疫组化结果表明，随着生殖器官不断发育成熟，SjFz5蛋白的阳性信号也逐渐增强。综合这两方面的结果我们推测，在童虫阶段负责虫体细胞增殖、器官分化的SjFz5蛋白，在虫体发育接近成熟时该信号通路完成了使命，之后保持在较低的水平，以维持机体相应器官的动态平衡，比如再生或凋亡。而负责虫体生殖细胞发育的SjFz5蛋白mRNA，一直以一定的水平维持表达，以促进生殖器官的发育成熟。在Wnt信号通路中，Wnt信号分子与Frizzled跨膜受体之间的结合是常见有冗余性的，一个受体可以与多个配体结合，反之亦然[15]。而这种结合的有无或先后是取决于生物发育的需要。我们推测SjFz5蛋白在童虫阶段和成虫阶段可能与不同的配体结合，来启动不同的Wnt信号，以达到不同的发育目的。当然，这一推论还需要进一步的实验证实。

图5 SjFz5蛋白在雌雄生殖系统中的分布(×400)Fig.5 The distribution of SjFz5 in the reproductive organs of schistosoma japonicum(×400)

性发育成熟的血吸虫雌虫产生的虫卵是引起宿主病理损害的主要原因，另外随粪便排出进入外部环境的虫卵又是引起血吸虫再传播的传染源。因此，探讨血吸虫生殖发育的分子机制，寻找合适的药靶，直接抑制血吸虫生殖系统的发育，对于减轻病情和阻断传播具有重要意义。SjFz5蛋白在血吸虫雌雄生殖器官上的明显分布，提示SjFz5引发的信号传递可能对血吸虫的两性生殖细胞的发育都有重要的调控作用，该蛋白具有作为抗血吸虫药物靶标的潜能。

图6 SjFz5在不同组织细胞上的跨膜分布(×1000)Fig.6 The transmembrane distribution of SjFz5 in different cells(×1000)

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