广西猪星状病毒分子流行病学调查

兰家暖，刘 磊，郭 旋，张民秀，卢冰霞，黄福标，覃熊慧，张 宁，黄伟坚*

(1.广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2.广西柯新源(集团)原种猪有限责任公司，广西 南宁 530001；3.横县石塘镇水产畜牧兽医站，广西 横县 530311；4.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西 南宁 530042)

星状病毒(Astrovirus，AstV)是一种人畜共患病病原，广泛分布于世界各地，除人以外还能够感染猪、牛、猫、水貂、鼠、鸡、鸭、猎豹、狗、蝙蝠和海豚等多种动物[1-2]。AstV感染人和其它哺乳动物主要引起肠道病毒性腹泻和呕吐，在禽除引起肠道疾病外还引起肾炎及致命性肝炎等疾病[3-4]。

猪星状病毒(PAstV)为1980年由Bridger等用电镜检测断奶3周龄猪腹泻粪便时发现，其所引起的疾病已成为危害养猪业的疫病之一[1]。许多国家对PAstV流行病学的报道显示，猪群中存在PAstV高感染率和高血清阳性率[5-6]。然而，该病在我国一直未受到重视，除商晓桂等对上海周边猪群进行PAstV调查之外[7]，未见有其它相关报道。鉴于其流行性和危害性，亟需对其深入研究。

本研究采用RT-套式PCR(RT-nPCR)技术，对广西猪场进行PAstV分子流行病学调查及基因型分析，明确PAstV在猪群中的流行情况，对猪场防制该病具有重要意义，对预防人兽共患AstV感染也具有重要的公共卫生学意义。

1 材料和方法

1.1 样品采集和处理 2008年12月～2010年12月，从广西7个市县29个不同规模猪场采集不同阶段猪腹泻粪便共315份(表1、表2和表3)，以PBS稀释成10%的悬液，3000 r/min，4℃离心10 min，取上清液用于病毒RNA的提取。

1.2 载体和受体菌 pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；DH5α感受态细胞由本实验室制备保存。

1.3 主要试剂 TRIzol、dNTPs、Biospin胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒均购自上海生物工程技术服务有限公司；TaqDNA聚合酶(5 U/μL)、内切酶HindⅢ和BamHⅠ购自Fermentas公司；M-MLV反转录酶(200 U/μL)购自Promega公司。

1.4 引物设计 参照文献[8]针对PAstV ORF25'端保守区合成两对引物进行RT-nPCR扩增，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5 RT-nPCR 按照TRIzol法抽提粪便处理液中病毒RNA，以AST665R作为反向引物反转录获得病毒cDNA；PCR反应参照文献[8]进行。

1.6 PCR产物的克隆 采用胶回收试剂盒对目的PCR产物进行回收，与pMD18-T连接；转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取重组质粒。

1.7 基因测序与样品统计分析 鉴定为阳性的重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序；采用统计学软件对不同阶段猪群、不同地点、不同季节PAstV感染情况进行统计分析。

1.8 序列比对及基因型分析 测定的序列以Laserge ne DNAStar 7.1软件包进行比对分析，MEGA 5.0 beta软件Neibor-Joining法构建系统发育进化树。本研究的参照序列为：PAstV-1(Y15938)、PAstV-1(AB037272)、PAstV(HM756258)、PAst V-2(GU562296)、PAstV(HM756259)、PAstV(HM756260)和PAstV(HM756261)。

2 结果

2.1 RT-nPCR检测结果 采用RT-nPCR方法，从猪腹泻粪便样品中扩增得到约180 bp的片段，与预期(183 bp)相符，初步证实猪群中存在PAstV感染(图 1)。

图1 RT-nPCR检测结果Fig.1 Defection of PAstV by RT-nPCR

2.2 广西PAstV流行情况 对广西7个市县共29个不同规模化猪场进行PAstV检测，结果显示猪场阳性率达82.8%(24/29)，共检测315份猪腹泻粪便样品，其中27份为阳性，阳性率达40.3%(表1)。

2.3 猪群不同日龄感染调查情况 对不同日龄猪群感染率进行调查，结果显示1日龄～30日龄阳性率最高(表 2)。

表1 广西各地猪场PAstV样品来源及检测结果Table1 Origins of Guangxi PAstV Fecal samples and results

续表1

表2 猪群不同日龄感染率情况Table 2 Infection rate of pigs at different ages

2.4 猪群不同季节感染情况 从2008年12月～2010年12月，分4个季节进行分析。结果显示PAstV春季感染率最高(表3)。

表3 猪群不同季节感染率情况Table 3 Infection rate of pigs in different Seasons

2.5 同源性比较 将鉴定为阳性的样品进行克隆和测序，获得46株PAstVs。同源性分析显示，46株PAstV之间核苷酸同源性为84.6%～100%，氨基酸序列同源性为51.1%～100%；克隆获得的46株PAstVs与PAstV参考株核苷酸序列同源性为45.1%～92.3%，氨基酸同源性为12.5%～81.2%。

2.6 基因型分析 采用MEGA 5.0 beta软件将46株PAstVs与GenBank中登录的7株PAstVs参考株构建进化树，结果显示本研究获得的46株PAstVs与参考株PAstV(Y15938)、PAstV(AB037272)、PAstV(HM756258)构成一大簇，均为PAstV-1型。根据Ulloa等[9]分型方法，可以将46株PAstVs分为a、b、c、d和 e共 5个亚群(图 2)。

另外，将获得的46株PAstVs与7株PAstVs参考株的ORF2编码的氨基酸序列进行多序列比对，根据各亚群特有的氨基酸也可以将46株分为5个亚群。a亚群在28A/E和38Y/H；b亚群在25F/L、26T/I；c亚群在37V/I、38Y/H、42W/R、43A/T、44K/E；d亚群在9H/Y、32V/L、42W/R；e亚群在2P/S、22G/S、26T/A和29D/H存在氨基酸替换。

图2 进化树分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on ORF2 sequences

3 讨论

PAstV可以引起爆发性或散发性猪胃肠炎，尤其对哺乳期仔猪影响较大，严重者可以引起脱水和死亡[4]。本研究2008年12月～2010年12月，从广西7个市县29个不同规模化猪场共采集不同阶段猪腹泻粪样315份，采用RT-nPCR方法对PAstV进行检测，经克隆和测序最终证实广西猪群中存在PAstV感染。

人源AstV(HAstV)感染存在明显的季节性，而PAstV的流行季节目前还不清楚。本研究结果显示，PAstV感染主要发生在春季和冬季，流行主要在11月份～次年4月份，即感染主要发生在天气寒冷及气温多变的季节。春季及冬季PAstV感染多发的原因可能是由于冬季天气寒冷，猪场保温措施及污物处理不当；而春季天气变化较大，对猪的应激最大，猪群免疫机能下降时最容易被感染。另外，在研究PAstV的过程中，我们也对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)进行检测，其中PEDV阳性率为27.2%，PRV阳性率为25.6%，TGEV阳性率为7.2%，3种常见腹泻病原的检出率都明显比PAstV检出率低。本研究结合近几年来哺乳猪及断奶猪在天气寒冷时出现腹泻及死亡率高的状况进行调查，为猪场有效防控该病、减少养猪业的损失提供参考。

有关研究显示，HAstV主要感染5岁以下儿童[9]，而本研究证实PAstV主要感染断奶前仔猪，这与Luo等报道相似[6]；另外，本研究在正常猪粪便样品中检测出PAstV，表明有些猪感染PAstV后并不表现出临床症状，但可以作为PAstV的储存宿主及持续传染源而感染其它动物或人[6]。

本研究扩增获得的46条PAstVs序列均属于PAstV-1型，又可以分为5个亚群。相关研究表明，同种动物可能受到多个亚群PAstV感染及AstV可以跨过种间屏障传播和垂直感染[10]。本研究显示，某些采自不同时间、不同地点和不同日龄猪群的PAstV核苷酸相似性很高，甚至达100%，表明病毒株感染猪没有一定的日龄限制，同一亚群病毒株可以感染不同日龄的猪群，而这可能是由于猪场在引种时已感染该病原，或是被感染的仔猪从发病场出售到其它场时该病原得到传播；另外，某些采自同一时间、同一地点的同源性较低，表明即使在同一个猪场可能同时存在几个亚群病毒株流行，这可能是由于其从不同猪场引种而带来不同病毒株。

本研究表明PAstV在广西地区猪群中已存在，有必要进行深入的研究，以全面了解该病毒的流行病学和生物学特性，从而评估该病毒在仔猪尤其是断奶前仔猪的腹泻中所起的作用。

[1]Bridger J C.Detection by electron microscopy of caliciviruses,astroviruses and rotavirus-like particles in the faeces of piglets with diarrhoea[J].Vet Rec,1980,107(23):532-533.

[2]Rivera R,Nollens H H,Venn-Watson S,et al.Characterization of phylogenetically diverse astroviruses of marine mammals[J].J Gen Virol,2010,91(1):166-173.

[3]Mendez E,Aguirre-Crespo G,Zavala G,et al.Association of the astrovirus structural protein VP90 with membranes plays a role in virus morphogenesis[J].J Virol,2007,81(19):10649-10658.

[4]Knipe D M,Howley P M.Fields Virology[M].5th Edition,2007.

[5]Shimizu M,Shirai J,Narita M,et al.Cytopathic astrovirus isolated from porcine acute gastroenteritis in an established cell line derived from porcine embryonic kidney[J].J Clin Micro biol,1990,28(2):201-206.

[6]Luo Zhi-yao,Roi S,Dastor M,et al.Multiple novel and prevalent astroviruses in pigs[J].Vet Microbiol,2011,149:316-323.

[7]商晓桂.猪星状病毒的分离鉴定和荧光定量PCR检测方法的建立[D].内蒙古农业大学，2010.

[8]Indik S,Valicek L,Smid B,et al.Isolation and partial characterization of a novel porcine astrovirus[J].Vet Microbiol,2006,117(2-4):276-283.

[9]Liu Man-qing,Yang Bei-fang,Peng Jin-song,et al.Molecular epidemiology of astrovirus infection in infants in Wuhan,China[J].J Clin Microbiol,2007,45(4):1308-1309.

[10]Zhu Hua-chen,Chu D K W,Liu Wei,et al.Detection of diverse astroviruses from bats in China[J].J Gen Virol,2009,90(4):883-887.