蓝舌病病毒VP5蛋白的原核表达及其抗原性分析

赵大维，朱彦青，陈伟业，胡倩倩，殷倩倩，黄克和，步志高*

(1.南京农业大学动物医学学院，江苏 南京 210095；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江 哈尔滨 150001；3.南京农业大学公共管理学院，江苏 南京 210095)

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属的BT病毒（BTV)经虫媒传播引起的反刍动物的一种烈性传染病，病死率平均为30%，其中绵羊的病死率高达80%，给畜牧业造成严重损失。蓝舌病是OIE规定实时通报疫病。

BT迄今已发现有25种血清型[1]，其基因组含有10个双股RNA节段(dsRNA)，这10个dsRNA节段包裹于双层蛋白质衣壳内，编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3A)，7种结构蛋白的4种形成双层蛋白衣壳，内壳主要由VP3和VP7构成[2]，而外壳主要由基因片段L2和M5编码的VP2和VP5构成，约为病毒总蛋白的40%。VP2是病毒群特异性抗原和血凝素蛋白，诱导产生中和抗体，裂解VP2会使病毒丧失血凝活性，VP5也可能与中和抗体的产生和病毒毒力有关[3]。王健伟等通过在昆虫细胞中表达VP2和VP5蛋白及其特性研究表明，VP5可以增强VP2诱导中和抗体的能力，可以用于病毒样颗粒的装配和基因工程疫苗研究[4]。本研究利用原核表达载体pMAL-c2X系统表达了外壳蛋白VP5，对其免疫学特性进行了初步研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株、质粒和载体 12型BTV由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人畜共患病吴东来研究员惠赠；Topl0、TB1大肠埃希氏菌株、BHK-21细胞及pMAL-c2X载体均由本实验室保存；BTV VP5血清样品由表达BT VP5蛋白的重组小反刍兽疫病毒(rPPRV-VP5)免疫5只山羊制备(分别采取免疫前血清和免疫后3周的血清)，其中rPPRV-VP5为本实验室采用反向遗传技术救获的重组病毒。

1.2 主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、禽源反转录酶、EcoRⅠ、SalⅠ、DNA Marker均购自TaKaRa公司；质粒小量抽提试剂盒购自OMEGA公司；胶回收小量试剂盒、RNA提取试剂盒Viral RNA/DNA(mini)Kit购自上海华舜生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、蛋白预染Marker购自Fermentas公司；pMAL-c2X麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白表达试剂盒购自NEB公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 引物设计 根据12型BTV的基因序列，设计合成扩增BTV VP5基因的特异性引物：VP5-F序列5'-GCCGAATTCATGATGGGGAAGATCATTAAATC GC-3'(EcoRⅠ)和 VP5-R序列 5'-GCAGTCGACTCA CGCGTTTCGAAGCAT-3'(SalⅠ)，引物由南京金思瑞科技有限公司合成。

1.4 重组表达质粒的构建 BTV按照MOI 0.01感染BHK-21细胞，待细胞病变(CPE)达到70%～80%收获病毒，按照Viral RNA/DNA Kit提取试剂盒说明书提取BTV总RNA，反转录合成病毒cDNA。用设计的特异性引物对VP5基因进行PCR扩增。PCR反应程序为：98℃ 2 min；98℃ 15 s、58℃15 s、72℃3 min，35个循环；72℃7 min。PCR产物和pMAL-c2X载体经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理，连接并转化E.coliDH5α菌感受态细胞，抽提重组质粒，经鉴定为阳性的重组质粒由上海英骏生物技术有限公司测序，将序列正确的重组质粒命名为pMAL-VP5。

1.5 VP5重组蛋白的表达及纯化 将pMAL-VP5转化大肠杆菌TB1感受态细胞，重组菌37℃振荡培养至OD600nm=0.6时，加入IPTG，分别对IPTG浓度(0.2 mmol/L～1.0 mmol/L)以及诱导时间(1 h～6 h)进行优化。表达产物进行SDS-PAGE分析。参照NEB公司pMAL融合蛋白表达及纯化系统说明书进行重组蛋白的纯化。

1.6 表达产物的western blot检测 将重组菌裂解物经SDS-PAGE电泳后进行电转印至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的PBS封闭液中4℃封闭过夜，以HRP标记的抗MBP单克隆抗体(MAb)及DAB显色试剂盒进行western blot检测。

1.7 表达产物的间接ELISA检测 以500 ng/孔的重组蛋白包被96孔酶标板，4℃包被24 h。3%的鱼皮胶37℃封闭2h，PBST洗涤后，每孔加入100 μL待检羊血清(山羊BTV阳性、阴性血清用含30 g/L的鱼皮胶的PBS缓冲液以1∶50进行稀释)，37℃1 h，PBST洗涤 3次，每次 5 min。加入 100 μL HRP-兔抗山羊 IgG(1∶8000 稀释)，37℃ 1 h，PBST洗涤3次。以TMB作为底物，50 μL/孔，37℃作用10 min。加入50 μL/孔的2 M H2SO4终止反应，在酶标仪上测定OD450nm值。根据P/N值确定阴性、阳性血清的判定标准。

2 结果

2.1 目的基因扩增及重组表达质粒pMAL-VP5的构建 采用RT-PCR技术，用特异性引物VP5-F/R从BTV12感染细胞总RNA中扩增出约1600 bp的VP5基因cDNA片段(图 1)。将 PCR产物和载体pMAL经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，经双酶切鉴定pMAL-VP5重组质粒，插入的VP5基因与预期大小相符。

图1 VP5基因的RT-PCR扩增产物Fig.1 RT-PCR amplication of BTV VP5 gene

2.2 重组蛋白的诱导表达与诱导条件的优化SDS-PAGE电泳分析表明，重组菌诱导后出现一条约100 ku的蛋白条带，与预期重组蛋白分子量(112.2 ku)相符，而对照无此条带。此外，重组蛋白在IPTG 0.4 mmol/L和4 h时表达量达到最大。

2.3 重组蛋白的可溶性分析及纯化 对裂解诱导表达菌体经SDS-PAGE分析，诱导超声离心后的上清中存在VP5重组蛋白条带，表明重组蛋白主要以可溶形式表达(图2)。

图2 重组蛋白的可溶性分析Fig.2 Solubility analysis of the recombinant protein

采用NEB公司pMAL融合蛋白表达及纯化系统进行纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，可见一条清晰的蛋白条带(图3)。

2.4 Western blot分析 纯化蛋白的western blot分析结果表明，空载体在约50 ku处与MBP蛋白的MAb发生特异性反应，重组蛋白在100 ku处与抗MBP蛋白的MAb发生特异性反应(图4)，表明VP5与MBP标签蛋白以融合蛋白形式存在。

图3 纯化蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

图4 MBP-VP5蛋白的western blot检测Fig.4 The western blot analysis of the recombinant protein MBP-VP5

2.5 间接ELISA方法的检测结果 将纯化的重组蛋白作为包被抗原，检测rPPRV-VP5免疫的山羊血清，结果显示：5份羊血清中有1份的检测结果P/N值为2.396，大于2.0，判定为阳性，表明表达的重组蛋白可以检测出BTV阳性血清,其余的值为1.003～1.763，均小于2.0，为BT阳性可疑血清(表1)。

表1 重组蛋白(rVP5)间接ELISA检测山羊血清结果Table 1 The results of goat serum by indirect ELISA with rVP5

3 讨论

本研究利用原核表达系统表达BTV的VP5蛋白，已知pMAL-c2X载体的标签蛋白约为53 ku，VP5基因编码蛋白的大小59.2 ku，这与本研究所获得的重组蛋白大小约为120 ku。

有研究表明，同时表达VP2和VP5蛋白的重组病毒株，VP5可以直接影响BTV的中和抗体的产生，这可能与其构象对VP2蛋白的影响有关[5-6]。有报道，经过氨基酸重组的VP5特异性MAb能够中和非洲马瘟病毒抗体[7]。虽然VP5蛋白不能直接诱导中和抗体，但对于VP2中和抗体的产生起到了重要的增强作用，在BT疫苗的研制以及检测过程中，不仅要检测VP2的水平，同时检测VP5蛋白的表达水平对于监测BTV疫苗的效力具有重要意义。

由于没有12型BTV的临床血清样品，本研究采用了本实验室通过反向遗传拯救的rPPRV-VP5免疫山羊制备的血清。由于VP5的抗原性较差，重组病毒的免疫效果也不是十分清楚，因此最终的样品多为阴性，但仍然有一只羊的抗体为阳性，表明本研究表达的VP5具有一定的免疫原性，有作为检测12型BTV VP5抗体的价值。由于VP5的免疫原性较差，今后可以采用制备VP5的MAb，建立竞争ELISA检测方法，可以大大提高敏感性，实现其临床诊断的应用价值。

本研究获得了纯化的12型BTV VP5蛋白，该蛋白能够与BTV的阳性血清或VP5重组山羊痘病毒的血清反应，表明其具有良好免疫原性，为其今后作为BT重组疫苗免疫效力检测抗原并建立相应的诊断方法奠定了基础。

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