喜树碱对NIH/3T3细胞TLR3表达及活化的影响

刘 学，张馨月，吴秀萍，白 雪，李慧萍，郭 恒，孙树民，王学林*，刘明远*

(1.吉林大学人畜共患病研究所人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062；2.二炮装备研究院，北京 100085；3.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古 通辽 028000)

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)能够识别多种病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，引起天然免疫应答。TLR3是Toll样受体家族的成员，可以识别病毒的dsRNA(Doublestrand RNA)，并通过其胞外区与dsRNA的结合激活TLR3介导的信号转导途径，进而激活IRF3(Interferon regulatory factor 3)和 NF-κB，上调 IFN-β表达，介导抗病毒免疫应答[1-2]。

喜树碱(Camptothecin，CPT)属于单萜类吲哚生物碱，1966年由美国的Wall等首次从喜树的茎部分离纯化得到[3]。Priel等证明，H9细胞感染人免疫缺陷病毒(HIV)-ⅢB后，CPT可以显著抑制HIV的复制，这与CPT属于真核细胞拓扑异构酶Ⅰ抑制剂有关[4]。Kelly等也证明CPT可以有效抑制流感病毒的复制[5]。此外，也有实验利用喜树果粗提取液进行体外抗单纯疱疹病毒2型(HSV-2)试验，结果表明其有较强的抗HSV-2作用[6]。本研究初步检测CPT是否可以通过增加TLR3的表达发挥抗病毒作用。

1 材料和方法

1.1 细 胞 NIH/3T3(小鼠成纤维细胞系3115 CNCB00230)购自武汉中国典型培养物保藏中心。

1.2 主要试剂及仪器 CPT(M0294)购自国家物质标准信息库，纯度大于98%；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；Flow Cytometry Fixation and Permeabilization Kit I、抗小鼠TLR3单克隆抗体(MAb)和小鼠IFN-β ELISA试剂盒均为R&D公司产品；Poly(I∶C)为 Invivogen 产品。

1.3 细胞培养 NIH/3T3细胞采用DMEM培养基(10%FBS，100 U/mL青霉素，100 U/mL硫酸链霉素)，于37℃、5%CO2条件下培养。

1.4 CPT最佳使用量的确定 将CPT终浓度分别为 200 μg/mL、40 μg/mL、8 μg/mL、1.6 μg/mL、0.32 μg/mL和0.064 μg/mL的细胞培养液加入96孔板培养的NIH/3T3单层细胞中，同时设置阴性对照孔和空白孔，并做3个复孔；分别培养24 h、48 h、72 h。测定结果前更换为新鲜DMEM培养液，采用CKK-8试剂盒方法进行OD450nm值检测。并根据公式计算细胞存活率，将对细胞具有5%毒性的CPT浓度作为基本无毒性浓度：

细胞存活率=(OD值实验组-OD值对照组)/(OD值对照组-OD 值空白组)×100%

1.5 TLR3表达的流式细胞检测 在新鲜制备的NIH/3T3单层细胞中加入CPT终浓度为1 μg/mL(计算对细胞有5%毒性的CPT浓度作为基本无毒性浓度，取相近整数值)，做3个复孔，设置阴性对照和空白孔，孵育14 h；收集单个细胞，流式固定液固定后，透化液处理，加入PE标记的鼠抗TLR3的MAb，冰水浴30 min，300 μL PBS重悬，进行流式细胞检测。

1.6 IFN-β表达量的ELISA检测 在新鲜制备的NIH/3T3单层细胞中分别加入CPT及阳性对照药物poly(I∶C)，终浓度为1 μg/mL，并设置阴性对照组，取培养14 h后的培养液，按照小鼠IFN-β ELISA试剂盒说明书操作方法检测IFN-β；即读取每孔的OD450nm，计算IFN-β的表达浓度。

1.7 统计学分析 采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 细胞毒性试验 采用不同浓度的CPT处理NIH/3T3单层细胞，并通过CKK-8方法检测不同时间的细胞存活率。结果显示当CPT浓度为0.32μg/mL，24 h、48 h、72 h时，它对细胞的毒性分别为1%、2.88%和0(图1)。对数据趋势分析可得出CPT对细胞有5%毒性时的浓度约为 1 μg/mL，因此确定此浓度为CPT对该细胞的基本无毒浓度。

图1 CPT对NIH/3T3细胞的毒性试验Fig.1 Toxicity test of CPT to NIH/3T3 cell

2.2 CPT作用后NIH/3T3细胞TLR3的表达情况终浓度为1 μg/mL的CPT与细胞作用14 h后，流式细胞术检测3个复孔的细胞内TLR3的表达情况(图2)。CPT组和阴性对照组的TLR3平均荧光强度比较见图3，数据经SPSS13.0统计软件处理后得p<0.01，表明CPT作用后TLR3表达量显著增加。

2.3 CPT作用后IFN-β表达情况 利用ELISA试剂盒检测NIH/3T3单层细胞与CPT作用后IFN-β的表达情况，以OD450nm值为横坐标，IFN-β浓度为纵坐标，根据标准品的IFN-β浓度和OD450nm值，计算出样品的IFN-β浓度。检测结果表明，CPT作用后IFN-β分泌增加(图4)，而且数据经SPSS 13.0统计软件处理后得p<0.01，表明与阳性对照poly(I∶C)相比IFN-β显著增加。

图2 CPT处理后NIH/3T3细胞TLR3的表达Fig.2 Expression of NIH/3T3 cell TLR3 in present of CPT

图3 实验组和阴性对照组TLR3的表达情况Fig.3 Expression of TLR3 in experimental and negtive control group

图4 实验组和阴性对照组IFN-β的表达情况Fig.4 Expression of IFN-β in experimental and negative control group

3 讨论

TLRs在天然免疫中起到关键作用，其成员之一TLR3可以特异性识别dsRNA，在抗病毒免疫中也起到重要作用[2]。除dsRNA病毒本身具有dsRNA结构，包括RNA病毒和DNA病毒在内的大部分病毒复制过程中可产生dsRNA，并作为重要PAMP。TLR3在髓样DC、巨噬细胞、成纤维细胞和多种上皮细胞中均能够表达，当其识别dsRNA后，触发细胞因子的分泌(如IFN-β)，引起天然免疫应答，进而形成获得性免疫反应[1,7]。研究表明，利用合成的病毒dsRNA模拟物—poly(I:C)可诱导角膜基质细胞中TLR3上调，并诱导多种促炎细胞因子、趋化因子和黏附因子释放增加[8]。实验证明，PIKA(一种合成的dsRNA)作为一种有效的免疫佐剂可以增强季节性流感疫苗的免疫原性[9]，提示CPT也可以作为TLR3激动剂进一步应用于免疫佐剂或者其他临床实验。

本研究通过CPT对NIH/3T3细胞TLR3的激动作用进行了初步研究。结果表明，CPT作用后的细胞TLR3表达量增加，并且IFN-β表达也增加。喜树的提取物(主要为CPT)在传统中药中可以用于治疗多种疾病，例如，牛皮癣、病毒性疾病和癌症[10]。有研究表明CPT可以对一些病毒有抗病毒作用[4-6]。本研究结果也表明CPT可能通过某种机制刺激或诱导TLR3的表达，而且TLR3表达上调与IFN-β释放增加之间可能存在某种信号传导途径，其诱导机理有待进一步研究。

本研究结果表明CPT增加了TLR3的表达，对TLR3有激动作用，这为以后的进一步实验和临床中更好的应用CPT提供了一定的理论依据。

[1]Matsumoto M,Oshiumi H,Seya T.Antiviral responses induced by the TLR3 Pathway[J].Rev Med Virol,2011,21:67-77.

[2]Uematsu S,Akira S.Toll-like receptors and Type I interferons[J].J Biol Chem,2007,282(21):15319-15323.

[3]沈少华，刘姬艳，胡江琴，等.喜树碱生物合成途径及其相关酶的研究进展[J].中草药，2011，42(9)：1862-1868.

[4]Priel E,Showalter S D,Blair D G.Inhibition of human immunodeficiency virus(HIV-1)replication in vitro by noncytotoxic doses of camptothecin,a topoisomerase I inhibitor[J].AIDS Res Hum Retroviruses,1991,7(1):65-72.

[5]Serkedjieva J,Velcheva M.In vitroanti-influenza virus activity of the pavine alkaloid(-)-thalimonine isolated from Thalictrum simplex L[J].Antivir Chem Chemother,2003,14(2):75-80.

[6]李闻文，施凯.喜树果粗提取液体外抗单纯疱疹病毒2型试验[J].湖南医学，1993，2：74.

[7]Jin Bo,Sun Tao,Yu Xiao-hong,et al.Immunomodulatory effects of dsRNA and its potential as vaccine adjuvant[J].J Biomed Biotechnol,2010,ID690438.

[8]Liu Yang,Kazuhiro K,Ryoji Y,et al.Cytokine,chemokine,and adhesion molecule expression mediated by MAPKs in human corneal fibroblasts exposed to poly(I:C)[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(8):3336-3344.

[9]Lau Y F,Tang L H,Ooi E E.A TLR3 ligand that exhibits potent inhibition of influenza virus replication and has strong adjuvant activity has the potential for dual applications in an influenza pandemic[J].Vaccine,2009,27(9):1354-1364.

[10]Kathleen L,Yang Li-xi.Novel camptothecin derivatives[J].In Vivo,2005,19(1):283-292.