林麝肺源致病性大肠杆菌分离鉴定及毒力基因PCR检测

罗 燕，王 朋，赵洪明，冯亚文，武革利，程建国，邹立扣，康纪平，马炳存，李 蓓

(1.四川农业大学都江堰校区微生物学实验室，四川 都江堰 611830；2.石家庄市动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050000；3.河北省兽药监察所，河北 石家庄 050000；4.四川养麝研究所，四川 都江堰 611830)

林麝为国家一级保护动物，其麝香为传统的名贵中药材和高级动物香料，具有重要的经济价值[1]。自1953年以来，我国开展了人工养麝保护及利用麝资源的研究，尽管人工养麝取得了一定的进展，但仍然没有形成规模化养殖，其中一个很重要的因素是受到林麝肺炎的制约。大肠杆菌(E.coli)是引起林麝肺炎的致病原之一[2-3]。目前，对该病原的检测和鉴定仍然为传统检测方法，尚未有林麝致病性E.coli16S rRNA分子鉴定的报道。

E.coli一般分为共生性非致病E.coli，肠道致病性E.coli和肠外致病性E.coli3大类。目前致病性E.coli研究较多的为肠外致病性E.coli[4]。致病性E.coli之间存在较大的基因差异性，其中包括许多毒力基因编码的毒力因子，如：粘附素类、毒素类、摄铁因子类、血清抗性、侵袭类及其他毒力因子[5]。目前尚未见林麝肺源致病性E.coli(Lung pathogenicE.coli，LPEC)毒力因子的研究报道。

本研究通过传统方法和16S rRNA分子鉴定方法从患严重肺炎的林麝肺组织病料中分离到30株E.coli分离株，而且属于致病性E.coli，并对其粘附素类(afa/draB、iha、sfa/focCD)、铁转运系统类(sitD ep.a、sitD chr.、iucDa)、血清类(neuC、ompA)和毒素类(sat、vat)4大类毒力基因进行了检测，鉴定结果显示这些E.coli分离株属于LPEC。该研究为林麝E.coli的致病机理研究及其疾病防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病 料 从四川省都江堰市白沙养麝场和马尔康养麝场采集的94份患肺炎的林麝病料。

1.2 主要试剂 高保真TaqDNA聚合酶、dNTPS、DNA Marker(DL2000)、TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒均购自天根生物有限公司。

1.3 培养基和生化反应管 伊红-美兰培养基(EMB)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)均购自杭州微生物试剂有限公司；糖发酵管(包括乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和甘露醇)、葡萄糖蛋白胨水培养基(甲基红M.R.和伏-普V-P试验)、蛋白胨水培养基(吲哚试验)和枸橼酸盐利用培养基均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.4 实验动物 3周龄昆明小鼠62只，体质量为20 g～22 g，雌雄各半，购自四川大学实验动物中心。

1.5 引物的设计与合成 16S rRNA扩增通用引物：27 F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492 R(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')。10种毒力因子扩增引物参照文献[5-8]报道的序列合成，其中4个主要毒力基因扩增片段大小见表1。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.6 细菌的分离 对采集的94份林麝肺脏病料，划线接种于伊红-美兰培养基上，于37℃恒温培养16 h，挑单个具有金属光泽菌落革兰氏染色镜检，并于胰蛋白胨大豆肉汤培养基上增菌。

1.7 分离菌株的生化试验 将分离菌株划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基上的，挑取纯菌落分别接种于5种糖(葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇)生化管、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基和枸橼酸盐培养基中，按照杭州微生物试剂有限公司生化反应使用说明培养。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第8版标准判定试验结果[9]。

1.8 分离菌株的小白鼠致病性试验 供试验的小白鼠，实验前禁食、禁水24 h。试验小鼠腹腔接种分离菌液0.2 mL/只(2×109cfu)。对照组注射同体积的无菌生理盐水。接种后对各组小鼠的发病和死亡情况进行统计。

1.9 分离菌株的16S rRNA PCR鉴定 以TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒提取的细菌分离株DNA为模板，采用通用引物27 F和1492 R进行PCR扩增。扩增反应程序：94℃3 min；94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，30次循环；72℃ 10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶检测。回收的PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

表1 林麝肺源致病性E.coli毒力基因扩增引物Table 1 PCR primers of LPEC virulence gene amplifications

1.10 分离菌株10种毒力基因的PCR检测 分别提取各分离株DNA作为模板进行毒力基因PCR检测。PCR体积25 μL，扩增反应程序：94℃3 min；94℃30 s、退火30 s(10种毒力基因的退火温度见表1)、72℃延伸3 min，25次循环；72℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 细菌分离和生化试验 通过伊红-美兰培养基的筛选，从94份病料中分离出E.coli30株，革兰氏染色均为阴性。经葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖和麦芽糖发酵试验及M.R.、V-P、吲哚和枸橼酸盐利用共9项生化试验鉴定，分离的30株细菌大部分符合E.coli的典型生化特征，仅有个别分离菌株不符合E.coli的典型生化特征。

2.2 分离菌株对小白鼠的致病力 小鼠在接种后先后表现出不同程度的精神萎靡，食欲降低，毛被散乱，此外还表现出抽搐，颤抖等神经症状。阴性对照组小鼠无异常症状。各感染组小鼠在感染后3 d～7 d陆续出现死亡，小白鼠死亡率达到100%。死亡小鼠剖检后病变主要为：肺脏、心脏、肾脏均有不同程度的肿大或出血，肺部切面暗红色，偶见小化脓斑点。小肠有明显的肠腔积液及粘连。实验组受检小鼠肺脏、肾脏以及心脏活菌分布基本一致，脏器中细菌回归检测，阳性率为100%。经t检验，肺脏带菌率显著高于其他脏器(p<0.01)。

小白鼠致病试验表明30株林麝E.coli均能够引起小白鼠出现明显的临床症状和实质器官的病理变化，同时从小白鼠实质器官中能分离到E.coli。鉴定结果表明，这30株为致病性E.coli。

2.3 分离菌株的16S rRNA PCR分子鉴定 30株分离菌株经16S rRNA特异性引物进行PCR扩增均能够出现一条约1.6 kb的片段，部分电泳图谱见图1。其测序结果与 GenBank中已知的E.coli16S rRNA序列进行比对，同源性达到97%～99%，16S rRNA鉴定结果表明30株分离菌株为E.coli。

图1 林麝LPEC分离株的16S rRNA电泳结果Fig.1 Identification of LPEC isolates by 16S rRNA PCR amplifications

2.4 分离菌株10种毒力因子的PCR检测 30株林麝LPEC中，ompA毒力基因检出率为80%，远远高于其他毒力基因，如sat(36.67%)、vat(26.67%)和 iucDa(23.33%)；而 neuC、sitD ep.a、sfa/focCD、afa/draB、iha和sitD chr.毒力基因的检出率均为阴性(0/30)。林麝LPEC的毒力因子检测结果见表2。

表2 林麝肺部致病E.coli10种毒力因子检测结果Table 2 Detected results of 10 virulence factors of 30 LPEC isolates in musk deer

3 讨论

本研究中细菌初期分离阶段，使用麦康凯培养基筛选E.coli，但发现长出的桃红色菌落并非全部为E.coli，所以后期筛选E.coli选用了伊红-美兰培养基，减少了假阳性现象的出现。30株患肺炎林麝病料中分离菌株的生化试验结果大部分符合E.coli典型生化特征，仅有个别菌株的生化试验出现不符合的情况。

本研究将30个分离菌株通过16S rRNA PCR扩增，所得到的序列在GenBank中比对，结果显示与GenBank中E.coli16S rRNA的同源性达到97%～99%。据报道凡是16S rRNA序列的同源性大于97%便可认为是同一种[10-11]。结合16S rRNA PCR分子鉴定结果和生化鉴定的结果，可将30个分离菌株鉴定为E.coli。本研究为临床快速检测林麝E.coli的提供了依据。

由于林麝是国家一级保护动物，规定不允许作为实验动物，因此选取了实验动物小白鼠。采用腹腔注射的途径。实验结果表明，分离株对小鼠具有致死性。

E.coli的致病性与毒力因子关系密切。E.coli毒力因子种类繁多。毒力因子的存在决定了所致疾病的种类和严重程度[5,12]，本研究对临床分离的30株林麝LPEC用PCR方法进行了10种毒力因子相关基因的检测。结果表明，从30株林麝肺LPEC分离菌株中检测到24株菌具有ompA基因，表明ompA基因在林麝LPEC肺炎的致病中同样起着重要的作用。但在这些分离菌株中却未能检测出neuC、sitD ep.a、、sfa/focCD、afa/draB、iha和 sitD chr.这 6 种毒力基因，而据Ewers报道，这6种毒力基因在尿道致病性E.coli(UPEC)、禽致病型E.coli(APEC)、新生儿脑膜炎E.coli(NMEC)均有一定的检出率[5]。林麝LPEC部分毒力基因与其他已报道的肠外致病性E.coli毒力基因表现出较大的差异性，这是由于种属特异性还是毒力基因进化造成，尚待进一步的研究。林麝LPEC毒力基因的研究，为进一步了解林麝LPEC病的致病机理奠定了基础，同时为开发相关疫苗，防治林麝LPEC性肺炎提供了依据。

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