鸡毒支原体穿梭质粒的构建

胡美容，陈鸿军，于圣青，谭 磊，仇旭升，高 崧，丁 铲*

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.中国农业科学院上海兽医研究所国家家禽工程技术研究中心，上海 200241；3.国家家禽工程技术研究中心，上海 200331)

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)感染引起的慢性呼吸道疾病(Chronic respiratory disease，CRD)是造成养鸡业严重经济损失的主要疾病之一[1-2]。确定毒力因子是研究MG的致病机制的关键[2]。然而，除了丝状支原体丝状亚种、关节炎支原体、和肺炎支原体等少数种类以外，大多数支原体目前尚未发现质粒存在[3]，大部分基于质粒的基因操作工具不适用于支原体，从而限制了MG毒力基因的研究[4]。最近，人工改造的mini-Tn4001在该支原体中得到应用[5-6]，但是转座子在基因组中插入位点具有随机性，对靶向基因缺失的筛选工作量大，并且随机插入往往使基因表达分析变得更加混淆[7]。

为了使构建的同源重组质粒在支原体内稳定存在，提高靶向基因的缺失效率，构建的载体需在支原体中可连续复制。一些可复制载体已在上述含有质粒的几种支原体中被使用，主要是基于测序的支原体染色体复制原点(oriC)进行构建，但在不含质粒支原体中这种载体的应用尚不多见[3,8-12]。由于oriC具有严格的宿主特异性，Rohini等构建了无乳支原体的穿梭质粒[13]；Lee等基于MG oriC原点构建可复制性载体，这些质粒在模拟支原体(M.imitans)和MG染色体外可以自行复制，利用同源重组使vlhA基因失活[7]，但该载体可以在支原体的oriC区域出现整合，并且难以稳定传代。

本研究基于上述研究结果，构建基于MG oriC部分活性区域的可复制型载体，并且可以在MG中稳定存在、在传代过程中整合几率低，为研究利用该载体进行毒力基因的靶向缺失研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 细菌和质粒 MG Rlow强毒株为本实验室保存(液体培养基中传代小于10代)；pBluescript-SK(+)载体购自Clontech公司；Bactobac杆状病毒穿梭载体pFAST-Bac1购自Invitrogen公司；mini-Tn4001 GmR载体为含有mini-Tn4001和编码庆大霉素乙酰转移酶的aacC1基因完整ORF(包含启动子部分)的MG通用转座载体为本实验室构建并改造[5]。

1.2 主要试剂 质粒DNA提取试剂盒、凝胶回收DNA试剂盒均购自德国QIAGEN公司；限制性内切酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA连接酶均购自美国Promega公司；ATCC 243号支原体培养基Bacto心浸肉汤、琼脂粉均购自BD公司；灭活马血清和猪血清购自Gibco公司。

1.3 MG DNA提取 MG Rlow株生长于预热的完全培养基中(含10%灭活马血清+10%猪血清+10%新鲜酵母浸液)，于5%CO2培养箱静置培养3 d或摇床中培养16 h至对数生长期。将培养液12000 r/min 10 min，沉淀以 0.01 M PBS洗涤 3次，用 50 μL 0.01 M PBS悬浮，煮沸10 min，高速离心10 min，取上清，测定DNA含量，-20℃分装保存。

1.4 MG oriC部分片段的扩增 根据MG oriC假定区域(图 1)和 MG Rlow株 oriC基因序列[14]，设计oriC短区的引物(表1)，引物两端分别加入XbaⅠ、BamHⅠ相应的酶切位点。PCR反应条件：95℃5min；94℃1 min、50℃ 45 s、72℃1 min，30个循环；72℃10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，经回收后，与pGEM-T载体连接，转化，筛选阳性克隆，测序。测序序列与MG Rlow株全基因(NC-004829)oriC同源区域进行比对。测序正确后经双酶切连接pBluescript-SK(+)载体，筛选阳性重组质粒，命名为pBSoriC。

1.5 庆大霉素抗性基因的扩增 根据编码庆大霉素乙酰转移酶的aacC1基因参考序列，设计特异性引物，在上游引物的5'端添加MG TufA蛋白的强启动子序列[15](TTTAGGGGTGTAGTTCAA)(表1)。以pFAST-Bac1载体为模板，扩增aacC1基因。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 可复制载体的构建 将上述扩增得到的PCR产物经HindⅢ酶切，与同样酶切处理的pBSoriC载体4℃连接过夜，转化，挑取阳性克隆测序鉴定，将其命名为pBSoriC-GmR。将该载体转化DH5α，涂布含100 μg/mL庆大霉素的LB平板，检测庆大霉素的活性。并与mini-Tn4001GmR载体进行对比。

1.7 电转化及抗生素筛选 采用无内毒素的质粒DNA试剂盒提取pBSoriC-GmR重组菌质粒DNA，测定DNA纯度及含量，分装冻存于-80℃。电转化条件同文献[5]～[7]报道。取150 μL电转化培养物涂在含有100 μg/mL庆大霉素的ATCC固体培养基中，置于37℃，5%CO2培养5 d～7 d。

将MG单菌落接种于不含庆大抗生素的ATCC培养基中，37℃，5%CO2培养3 d～5 d后，取发生颜色变化的单克隆培养物200 μL提取基因组DNA，用 aacC1引物(gen-Fwd2/gen-Rev2)进行 PCR鉴定。另取200 μL转接种到含有100 μg/mL庆大霉素的ATCC培养基中，观察其能否继续传代。

1.8 庆大霉素乙酰转移酶鼠多抗的制备 采用aacC1基因引物(gen-Fwd2/gen-Rev2)扩增，连入pET-28a(+)载体中，转化BL21(DE3)宿主菌，用0.5mM IPTG诱导表达。超声波裂解(400 w，工作时间5 s，间歇时间5 s，99次)，12000 r/min离心15 min，收集上清和包涵体进行SDS-PAGE检测，纯化表达产物。将纯化的庆大霉素乙酰转移酶蛋白样品免疫6周的BALB/c小鼠，免疫剂量为100 μg/只，四免后采血检测。

1.9 Western blot检测 取5 mL对数生长中后期的的各电转化单克隆菌落的二代培养物，进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，5%脱脂乳封闭，一抗为1∶103稀释的庆大霉素乙酰转移酶鼠多抗血清，二抗为HRP标记羊抗鼠IgG，1∶104稀释，37℃作用2 h，洗涤后，用DAB显色试剂盒显色。

2 结果

2.1 可复制载体的构建 根据MG的全基因组测序结果，预测的oriC区域主要分为长区和短区，其中，oriC短区位于soj基因和dnaA基因之间(图1)。扩增获得oriC短区大小为670 bp(图2A)。将该片段克隆入pBlueScript SK(+)载体中，命名为pBSoriC。再将编码庆大霉素乙酰转移酶的aacC1基因(图2B)亚克隆入该重组质粒中，经测序构建获得pBSoriC-GmR 载体(图 3)。

图2 MG oriC短区片段和aacC1基因PCR结果Fig.2 PCR results of MG oriC short region andaacCIgene

2.2 可复制载体tuf启动子活性检测 将pBSoriCGmR和mini-Tn4001GmR载体分别转化DH5a，涂布含100 μg/mL庆大霉素的LB平板，检测细菌生长情况，对比阳性对照mini-Tn4001GmR，耐药基因启动子为aacC1基因本身的启动子，而pBSoriC-GmR载体的aacC1基因是由tuf启动子启动的庆大霉素耐药基因，转化结果显示在抗性平板中两种载体转化的重组细菌均生长良好，而对照pBSoriC重组菌无细菌生长(图4)。

图3 pBSoriC-GmR模式图Fig.3 pBSoriC-GmR model chart

图4 tuf启动子活性检测Fig.4 Activity detection of tuf promoter

2.3 MG电转化及PCR鉴定结果 经电转化和抗生素筛选，在显微镜下挑取固体平板中生长良好的MG单菌落，共100株，经液体培养，取发生颜色变化的单克隆培养物200 μL提取基因组DNA，用aacC1引物(gen-Fwd2/gen-Rev2)进行PCR鉴定。结果显示第66和78号单克隆呈阳性反应(图5)。

图5 电转PCR鉴定结果Fig.5 Identification results of transformants

2.4 转化子稳定性鉴定 分别取200 μL两株单克隆转接种到5 mL含有100 μg/mL庆大霉素的ATCC培养基中，继续传20代。66号转化子传到第4代时无法在含有100 μg/mL的庆大霉素培养基中继续生长。78号转化子在庆大霉素浓度为250 μg/mL的液体培养基中仍能成长良好，目前已传至22代。

为检测tuf启动子启动庆大霉素抗性基因的活性，以鉴定该载体是否可以表达外源基因，本实验利用原核表达系统可溶性表达庆大霉素乙酰转移酶(图6A)，制备获得小鼠多抗血清。利用获得的庆大霉素乙酰转移酶多抗血清，对电转化的78号单克隆传代培养产物进行western blot检测，结果显示该克隆第4、10和22代培养产物均高效表达该庆大霉素抗性基因(图6B)，表明该载体在MG中稳定传代。

图6 庆大霉素乙酰转移酶表达的SDS-PAGE及western blot检测结果Fig.6 Detection of gentamicin acetyltransferase expression by SDS-PAGE and western blot

3 讨论

MG的Rlow和F株全基因组序列的公布为功能基因的研究提供了便利条件[14,16]，然而，对于肺炎支原体、生殖支原体和MG而言，至今未发现任何质粒存在，并且对外源质粒载体不兼容，基于质粒载体的基因操作手段无法在该类支原体中有效开展[7]。虽然利用具有四环素抗性基因筛选的Tn916和Tn4001转座子能够在MG中转座，但由于存在基因组太大和插入位点的随机性等缺点，给深入研究带来的诸多不便[5-6,17-19]。

Janis等发现丝状支原体丝状亚种存在质粒，这些质粒仅具有复制功能[9]。在构建可复制载体过程中，大肠杆菌的复制原点在丝状支原体初次传代时容易丢失。而基于支原体染色体的复制原点构建的人工质粒载体，可使外源基因在支原体中稳定存在。Cordova等利用鼠肺支原体的oriC构建成穿梭载体pMPO1载体，含dnaA基因及DnaA复制起始蛋白及上下游序列[20]。该载体能在大肠杆菌及肺炎支原体之间穿梭，并可在肺支原体中复制，但几代后出现整合入染色体oriC区域的现象。为了避免整合，提高稳定性，dnaA基因从oriC区域中去除，替代为tetM基因。pMPO5载体至少可以在液体培养物中传15代，经检测该载体未整合入基因组。

在大多数的细菌中，oriC都位于dnaA基因区域内。Papazisi L等推测MG oriC区域位于dnaN和dnaA之间，oriC区域含5个DnaA表达盒序列，并且每一个DnaA盒均具有保守的9nt序列(5'-TTW TMHAMA-3')，在dnaN和soj区域间富含AT高达80%，整个区域长度为3.16 kb[14]。在早期的研究中，基于oriC构建的重组质粒均包含一个较大的oriC区域，包含有多个dnaA和soj基因，这一载体极易整合入基因组DNA的oriC区域[3,11-12,21]。Lee等基于MG oriC原点构建可复制性载体，并将oriC分为长区和短区，大小分别为：1889 bp和670 bp[7]。这些质粒在模拟支原体(M.imitans)和MG染色体外可自行复制，利用同源重组成功使vlhA基因失活。但这一载体仍在支原体的oriC区域易整合，并且难以稳定传代。

研究表明柠檬螺原体的可复制载体的oriC序列仅包含dnaA基因下游163 bp，该区富含AT，而不包含soj基因。为了构建能够在MG中稳定存在的可复制性载体，并降低该载体整合入基因组的几率，本研究构建了MG oriC部分区域(短区)的重组质粒，而该区在soj基因下游，包含两个DnaA表达盒，无AT富集区。经电转化鉴定，该oriC序列可以作为oriC稳定复制，并在MG中稳定存在22代以上，并高效表达庆大霉素乙酰转移酶。这表明该载体在MG中可以相对稳定地高效表达外源基因。这一结果为利用MG作为表达载体奠定了良好基础。下一步的研究将在该载体中插入其他病原体的保护性基因，并对目的基因进行适当修饰，以利于表面定位，增强免疫原性。

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