乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定

郝凤奇，李景梅*，杨桂连

(1.长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

乳酸菌作为人和动物消化道内的正常菌群，被公认为“安全级”的微生物[1]。构建乳酸菌质粒表达载体对于制备功能性重组乳酸菌至关重要。Nisin为由某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌的一种小分子抗生物肽，由34个氨基酸组成，分子量约为3.5 ku，能够抑制多数食品腐败菌的生长，对人和动物无害，是一种高效、无毒的天然食品防腐剂[2]。Nisin生物合成的基因簇包括：nisABTCIPRKFEG，nisR与nisK构成双组分调控元件。Nisin的合成遵循密度感受原理，首先，nisR的组成型启动子持续启动nisK表达组氨酸激酶(NisK)，同时nisR自身编码应答调节蛋白(NisR)；其次，NisK为膜结合感应蛋白，其N末端位于细胞外，可在少量Nisin存在时，发生自身磷酸化，并将磷酸基团传递给细胞内的NisR；最后，磷酸化被激活的NisR可作为转录激活物启动下游诱导型启动子nisA/nisF的基因表达。

本研究将Nisin生物合成的双组份调控元件nis-RK基因亚克隆至pW425et中，并以诱导型启动子nisA基因替换基础质粒中的组成型启动子P32，构建乳酸菌Nisin诱导表达质粒载体pW425N，以gfp作为报告基因，检测载体的诱导表达功能。研究结果为功能性重组乳酸菌的制备和应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 质粒与菌种 分泌型基础质粒pW425et、含有gfp基因的质粒pGEM-T-gfp由吉林农业大学王春凤教授惠赠；pGEM-T-nisRK由本研究室构建[3]；猪源嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)分离自仔猪肠道，产NisinL.lactis分离自牛乳，均由吉林农业大学动物微生态学研究室保存；pMD18-T购自TaKaRa公司；E.coliDH5α感受态细胞购自TaKaRa公司。

1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA连接酶及各种限制性内切酶购自TaKaRa公司；染色体提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA清洁试剂盒购自Axygen公司；Nisin购自Sigma公司。

1.3 nisA和gfp基因的克隆与序列分析 根据GenBank登录的nisA(AF465351.1)和gfp(U76561.1)基因序列，结合基础载体的酶切位点设计引物，由TaKaRa公司合成。nisA上、下游引物分别为：5'-GGGGAATTCATTAAATTCTGAAGT-3'(EcoRⅠ)、5'-GGGGGATCCTTATTTGCTTACGTG-3'(BamHⅠ)，gfp上、下游引物分别为：5'-GTTCCGCGGATGACC ATGATTACG-3'(SacⅡ)、5'-GGGATCGATTTATTT GTAGAGCTC-3'(ClaⅠ)。提取L.lactis染色体，并以其为模板，PCR扩增nisA基因。以pGEM-T-gfp为模板扩增gfp基因。回收纯化目的基因，与克隆载体连接，分别构建pMD18-nisA和pMD18-gfp，经酶切和PCR鉴定后，筛选阳性重组体进行序列测定，测序结果采用Blast软件比对序列相似性。

1.4 nisRK基因穿梭重组质粒的构建 采用XbaⅠ和KpnⅠ分别对pGEM-T-nisRK和pW425et进行双酶切，试剂盒回收nisRK基因和pW425et大片段，T4 DNA连接酶连接，并转化E.coliDH5α感受态细胞，以红霉素筛选阳性重组质粒，采用酶切和PCR方法鉴定阳性重组质粒pW425et-nisRK。

1.5 诱导型启动子nisA替换组成型启动子P32采用EcoRⅠ和BamHⅠ分别对pMD18-nisA和pW425et-nisRK进行双酶切，试剂盒回收nisA基因和pW425et-nisRK大片段(已通过EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切去除组成型启动子P32)，T4 DNA连接酶连接，并转化E.coliDH5α感受态细胞，以红霉素筛选阳性重组质粒，采用酶切和PCR方法鉴定重组质粒，并命名为pW425N。

1.6 重组表达质粒的构建 采用SacⅡ和ClaⅠ分别对pMD18-gfp和pW425N进行酶切，试剂盒回收gfp基因和pW425N载体，T4 DNA连接酶连接，构建pW425N-gfp，并电转化L.acidophilus受体菌。

L.acidophilus感受态细胞的制备及电转化参照文献[4]和[5]方法并作适当修改。挑取猪源L.acidophilus菌落接种于新鲜的10 mL MRS液体培养基中(含1%Gly)，37℃厌氧静止培养至菌体OD600nm值为0.6～0.8。按1%～2%剂量接种于新鲜MRS液体培养基(含1%Gly)，37℃厌氧静止培养，待菌体OD600nm值为0.2～0.3时，收集菌体培养物冰浴10 min，4℃6000 r/min离心5 min。沉淀以冰冷的清洗缓冲液(1.16 mmol/L Na3PO4、0.09 mmol/L MgCl2)清洗2次；4℃6000 r/min离心5 min收集沉淀，重悬于电击缓冲液(0.19 mol/L Sucrose、0.3 mmol/L MgCl2)中，冰浴5 min。取200 μL感受态，加入20 μL重组质粒pW425N-gfp，混合后于预冷的电极杯中(Φ20 mm)，冰浴5 min后进行高压电转化。冰浴5 min，将内容物转至800 μL新鲜的液体MRS培养基中，37℃厌氧静止复苏4 h～5 h，涂布含有红霉素(400 μg/mL)的 MRS平板，37℃厌氧静止培养 16 h～20 h，筛选阳性重组菌扩增培养，提取质粒采用酶切和PCR方法进行鉴定。

1.7 gfp基因在L.acidophilus中的诱导表达

1.7.1 猪源L.acidophilus对Nisin耐受浓度(RC)和最小抑菌浓度(MIC)的确定 挑取猪源L.acidophilus单个菌落接种于新鲜MRS培养基，37℃厌氧培养至菌液OD600nm值为0.6～0.8时，取菌液按1∶100比例分别接种于含有不同有效浓度Nisin(10 ng/mL～60 ng/mL)的MRS培养基。37℃厌氧培养过夜后测定菌液OD600nm值，确定受体菌对Nisin的RC和MIC。

1.7.2 Nisin对gfp基因诱导表达时间的确定 将阳性重组菌pW425N-gfp/L.acidophilus接种于MRS培养基中(红霉素400 μg/mL)，37℃厌氧培养至菌液OD600nm值为0.6～0.8时，添加有效浓度为10 ng/mL的Nisin进行诱导表达。菌液OD600nm值为0.6～0.8时，记为诱导0 h，添加Nisin后，每隔1 h取菌液，至7 h；将收集的菌液用液体MRS培养基调OD600nm值为0.6～0.8，4℃ 4000 r/min离心10 min，沉淀用无菌生理盐水清洗3次，重悬于生理盐水中。采用荧光分光光度计在激发光OD460nm波长下测定样品OD509nm波长下的相对荧光强度，以确定最适诱导表达时间。

1.7.3 gfp基因诱导表达所需Nisin的最佳有效浓度的确定 将阳性pW425N-gfp/L.acidophilus接种于MRS培养基中，37℃恒温厌氧培养至菌液OD600nm值为0.6～0.8时，向培养基中添加Nisin，使有效浓度分别为10 ng/mL～60 ng/mL；诱导表达后，分别取不同组样品，测定收集菌液的相对荧光强度。同时，取重组菌菌液100 μL，10倍稀释后分别进行革兰氏染色和荧光显微镜观察。

1.8 统计分析 采用GraphPad Prism 5 Demo进行统计分析和作图，结果采用平均数±标准差表示。

2 结果

2.1 nisA基因和gfp基因的PCR扩增 以提取的L.lactis染色体为模板，PCR扩增nisA基因，扩增片段与预期大小相符(251 bp)。以pGEM-T-gfp为模板，扩增gfp基因，扩增片段与预期大小相符(792 bp)。序列测定结果表明，扩增的目的基因与模板序列(AF465351.1和U76561.1)相似性为100%。

2.2 表达载体pW425N的鉴定 基础质粒pW425et大小为4.8 kb，nisRK基因大小为2.0 kb，重组载体pW425et-nisRK采用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切，分别在4.8 kb和2.0 kb处可见清晰条带；诱导型启动子nisA为251 bp，重组载体pW425et-nisRK原组成型启动子为113 bp，替换启动子后，大小为6.9 kb，以替换前后的载体为模板进行PCR鉴定，pW425N为模板的泳道在251 bp处可见清晰条带，应用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pW425N，分别在6.7 kb和251 bp处可见清晰条带(图1)。结果表明构建了乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N(图2)。将pW425N和gfp基因的连接产物电转化猪源L.acidophilus，筛选阳性重组菌，提取质粒，用SacⅡ和ClaⅠ进行酶切鉴定，结果在约6.9 kb和792 bp处分别出现目的条带，与预期结果相符(图3)，表明构建了重组表达载体pW425N-gfp。

图1 乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N的鉴定Fig.1 Identification of pW425N by restriction enzyme digestions

图2 pW425N载体图谱Fig.2 Map of pW425N

2.3 猪源L.acidophilus对Nisin的RC和MIC 将受体菌L.acidophilus接种于含有不同浓度Nisin的液体MRS培养基中，培养过夜后测定菌液OD600nm值，结果表明，RC为40 ng/mL，MIC为60 ng/mL(图4)。此外，当Nisin有效浓度为10 ng/mL时，受体菌仍然生长良好，因此，以该浓度为标准对gfp基因诱导表达时间进行测定。

图3 重组载体pW425N-gfp酶切鉴定Fig.3 Identification of pW425N-gfp by digested with enzyme

图4 猪源L.acidophilus对Nisin的敏感浓度Fig.4 Sensitive concentration ofL.acidophilusfor Nisin

2.4 Nisin对gfp基因的诱导表达时间 以有效浓度为10 ng/mL的Nisin为诱导物，对gfp基因进行诱导表达。结果表明，非诱导条件下未见绿色荧光，而诱导3 h时绿色荧光蛋白的相对荧光强度达最高值，为341.7±0.20。

2.5 gfp基因诱导表达所需Nisin的最佳浓度 重组菌 pW425N-gfp/L.acidophilu生长至 OD600nm值为0.6～0.8时，向培养基中添加不同浓度的Nisin，诱导3 h后，测定不同浓度下菌液的相对荧光强度。结果表明，Nisin的有效浓度为30 ng/mL时绿色荧光蛋白的相对荧光强度达最高值588.5±0.16。

2.6 重组菌pW425N-gfp/L.acidophilus表达GFP的观察 添加30 ng/mL的Nisin对pW425N-gfp/L.acidophilus诱导3 h后，取菌液100 μL，10倍稀释后进行革兰氏染色和荧光显微镜观察，并以不含gfp基因的重组菌pW425N/L.acidophilus做阴性对照。结果表明，重组菌pW425N-gfp/L.acidophilus在荧光显微镜下呈现明显的绿色荧光(图5)。

3 讨论

图5 革兰氏染色和荧光显微镜观察(1000×)Fig.5 Observation by recombinant bacteria by Gram staining and fluorescence microscope(1000×)

启动子P32为组成型启动子，是从乳脂链球菌中克隆得到，包括开放阅读框和一个能被E.coli、枯草芽孢杆菌和乳链球菌识别的核糖体结合位点。pMG36e是首个利用启动子P32构建的乳酸菌组成型表达载体，应用该载体已表达了溶菌酶、苯丙氨酸酶、枯草杆菌中性蛋白酶、超氧化物岐化酶，以及幽门螺旋杆菌热休克蛋白A、黏附素Hp0410等抗原蛋白[6-8]。本研究所采用的基础质粒pW425et[9]中含有P32组成型启动子，利用该载体表达猪A组轮状病毒VP4、VP7保护性抗原蛋白、新城疫病毒F保护性抗原蛋白和鸡白痢沙门氏菌外膜蛋白C等[10-13]，为功能性重组乳酸菌的开发和应用奠定了基础。

本研究构建了Nisin诱导型表达载体pW425N。前期工作表明nisRK基因为部分重叠基因，其中的nisR启动子是一个较强的启动子[3]。本研究将nisRK基因整合至pW425et中，并在扩增诱导型启动子nisA基因时，在上下游引物分别加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，完成启动子的替换，并且扩增的nisA基因包括启动子的必须功能区，即-35区(ATTAAT)，1 bp～7 bp；-10 区(TACAAT)，24 bp～29 bp；核糖体结合位点(TAAGGAGG)，67 bp～74 bp。

Nisin是一种抗生物肽，执行诱导前须确定受体菌L.acidophilus对Nisin的RC和MIC，试验结果显示，最高诱导浓度应低于60 ng/mL，而当Nisin有效浓度为10 ng/mL时，GFP的相对荧光强度出现在诱导后的3 h，并且表明载体受控严格，与Kuipers等研究结论相符[14]；诱导1 h～3 h，GFP的相对荧光强度与诱导时间呈正相关，尽管诱导3 h GFP的相对荧光强度出现最大值，但诱导1 h的增加幅度最大，推测可能是与重组蛋白质的“代偿表达”有关，有必要进行深入研究。另外，在诱导3 h的条件下，Nisin的最佳有效浓度为30 ng/mL，并且在该浓度以前，GFP的相对荧光强度与Nisin的有效浓度呈现明显的“剂量-效应”关系，与Willem提出的观点一致[15]。此外，当Nisin有效浓度大于30 ng/mL时，结果正相反，可能是因添加的Nisin大于RC导致菌体生长缓慢，GFP表达水平呈下降趋势，以至于当浓度为60 ng/mL时(MIC)，几乎检测不到相对荧光强度。

本研究依据Nisin生物合成的密度感受原理，以乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et为基础质粒，构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N，该载体受控严格，表达产物与诱导物之间在一定范围内存在“剂量-效应关系”，为同源或异源功能性蛋白质在乳酸菌中的诱导表达和功能性重组乳酸菌制剂的研制提供了可操作的技术平台。

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